本文關鍵詞：牛源A型多殺性巴氏桿菌三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白功能研究

  更多相關文章： 多殺性巴氏桿菌 TAAs 免疫保護 細胞粘附 生物膜形成

【摘要】：多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)屬于革蘭氏陰性菌,根據(jù)其莢膜抗原不同分為A、B、E、D、F 5種血清型,根據(jù)其菌體抗原不同分為16個血清型。P.Multocida能夠感染多種動物,引起牛出血性敗血癥、牛肺炎、禽霍亂、豬萎縮性鼻炎等,給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。細菌感染機體過程中,細菌的定殖和繁殖與其粘附素有著密切關系。近年來研究發(fā)現(xiàn)一種新的非菌毛粘附素-三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素(TAAs),被認為是一種重要的毒力因子,它主要由頭部、莖部和錨定部三部分組成,其中頭部和莖部是其主要功能區(qū),參與細菌的粘附、侵襲、生物膜形成,與其自身凝集和抗血清作用也有一定關系;錨定部是TAAs家族特有的結構,具有三聚化作用,可以抑制SDS變性作用。來源于不同細菌TAAs的錨定部序列具有高度同源性,不同的氨基酸個數(shù)決定了TAAs的多樣性。此外TAAs也可以作為研究新型亞單位疫苗的候選靶標。目前國內(nèi)外對TAAs的研究比較少,只對副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的TAAs有相關研究,但是關于巴氏桿菌還未見報道。本實驗室前期通過生物信息學分析得到一個牛源A型多殺性巴氏桿菌的假定三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因pm1g0001。本實驗將其作為研究對象,通過分子生物學相關技術從理論和試驗方面證明其編碼的pm1g0001蛋白是YadA屬三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白;并通過免疫反應原性分析、粘附活性分析、生物膜形成方面來研究該蛋白具有的部分TAAs生物學功能。具體研究結果如下:1、三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素編碼基因pm1g0001的生物信息學分析根據(jù)本試驗室建立的牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2株基因數(shù)據(jù)庫,利用生物信息學在線分析軟件SignalP-3.0 server、TMHMM Server v.2.0、SMART對假定三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素Pm1g0001基因的信號肽、跨膜結構域進行分析;利用三聚體自轉(zhuǎn)運黏附素分析軟件daTAA分析蛋白的黏附基序。結果顯示,該蛋白編碼基因Pm1g0001的1-22aa為信號肽區(qū)域、1-84aa為跨膜域、211-411aa為TAAs部分,其中taas的ylhead頭部基序主要位于n端211-284aa處,莖部主要位于295-341aa,c端錨定部基序主要位于323-411aa處,說明該蛋白含有三聚體典型的頭-莖-錨結構,從理論上證明該假定蛋白是三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員。利用bcepredserver在線軟件對蛋白pm1g0001的b抗原表位進行線性化的預測;利用bepipred1.0server在線軟件和dnastar軟件包分析蛋白的二級結構、抗原指數(shù)、親水性、可極性等,預測蛋白pm1g0001的b抗原表位,綜合分析表明,pm1g0001的抗原表位主要位于21-315aa。2、三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的分段表達及其表達產(chǎn)物western-blot分析生物信息學分析結果發(fā)現(xiàn),三聚體部分主要位于pm1g0001基因編碼蛋白的211-411aa。根據(jù)分析結果,將pm1g0001分為整個pm1g0001基因(pm1g0001)、整個功能區(qū)(頭部和頸部:pm1g0001-1)、錨定部(pm1g0001-2)、整個三聚體部分(pm1g0001-3)、非三聚體部分(pm1g0001-4)、頭部(pm1g0001-5)和莖部(pm1g0001-6)7段,分別設計特異性引物并進行pcr擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后,以pet-30a(+)或pet-32a(+)為載體,轉(zhuǎn)入dh5α感受態(tài)中構建重組質(zhì)粒,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入bl21(de3)感受態(tài)細胞,經(jīng)誘導表達后得到重組蛋白。利用his親和層析柱將7個重組蛋白進行大量純化,并將產(chǎn)物進行western-blot分析。結果發(fā)現(xiàn)7個重組蛋白都具有良好的反應原性;此外,重組蛋白rpm1g0001-2在78kda處有條帶,是單體重組蛋白(26kda)的3倍,說明該蛋白錨定部具有三聚化的作用,由此證明蛋白pm1g0001是三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員。3、三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白pm1g0001的功能研究將純化后的重組蛋白rpm1g0001、rpm1g0001-1~rpm1g0001-6分別與佐劑混合后免疫小鼠,三免后,采集小鼠血液分離血清,采用elisa檢測其抗體效價;同時用6.8×105cfu的pmcq2肌肉注射攻毒小鼠,研究目的蛋白對小鼠的免疫保護效果。結果顯示,免疫組抗體效價范圍在1:51200~1:102400,說明重組蛋白可以刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高水平的免疫應答反應;其中重組蛋白rpm1g0001-3的抗體效價明顯高于其余6組,說明三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白可以刺激機體產(chǎn)生高滴度的抗體。攻毒保護性試驗結果顯示,重組蛋白rpm1g0001-3的保護效果最好,保護率達到70%,說明三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素對巴氏桿菌的感染具有很好的保護作用;重組蛋白rpm1g0001-5和rpm1g0001的保護率達到60%,rpm1g0001-1和rpm1g0001-6的保護率是40%,rpm1g0001-2保護率僅為10%,說明在整個rpm1g0001中起主要作用的是三聚體部分,而在三聚體中起主要作用的是功能區(qū),其中功能區(qū)頭部作用效果好于莖部。將純化后的重組蛋白rPm1g0001-1、rPm1g0001-3、rPm1g0001-5、rPm1g0001-6免疫小鼠,制備多克隆抗體。用制備好的抗體和陰性血清對C57BL/6小鼠巨噬細胞進行預處理后,加入PmCQ2感染4h,洗去未粘附的細菌,經(jīng)洗脫后進行粘附計數(shù),以研究重組蛋白抗體對巴氏桿菌粘附小鼠巨噬細胞的影響。結果表明,四種多克隆抗體都對PmCQ2粘附巨噬細胞有一定的抑制作用,且差異顯著;其中抗-Pm1g0001-3對細菌粘附的抑制效果明顯好于其余三組,說明三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白抗體對巴氏桿菌粘附宿主細胞具有一定的抑制作用,其中起主要作用的是功能區(qū)。將PmCQ2(1×108 CFU)加入細胞培養(yǎng)板中分別培養(yǎng)24h、48h、72h,檢測生物膜形成情況,在此基礎上,將制備的多克隆抗體抗-Pm1g0001-1、抗-Pm1g0001-3、抗-Pm1g0001-5、抗-Pm1g0001-6與陰性血清分別對含細菌的細胞培養(yǎng)板進行預處理,并測定各組的吸光值A630,以研究重組蛋白抗體對細菌生物膜形成的影響。結果表明,多殺性巴氏桿菌PmCQ2可以形成細菌生物膜,48h時形成生物膜現(xiàn)象最明顯;經(jīng)抗體預處理的4個實驗組A630極顯著低于對照組,說明4種抗體都能夠抑制細菌生物膜的形成,且在48h時抑制效果最好;48h時,抗-Pm1g0001-1的抑制效果最佳,抗-Pm1g0001-3的抑制效果好于抗-Pm1g0001-5和抗-Pm1g0001-6,抗-Pm1g0001-6的抑制效果好于抗-Pm1g0001-5,說明三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白抗體可以抑制細菌生物膜的形成,其中功能區(qū)起主要作用,且功能區(qū)中莖部抑制效果好于頭部。
【關鍵詞】：多殺性巴氏桿菌 TAAs 免疫保護 細胞粘附 生物膜形成
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 第1章 文獻綜述13-31
• 1.1 三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素的研究進展13-19
• 1.1.1 三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素的結構13-15
• 1.1.2 三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素的分泌機制15-16
• 1.1.3 三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素的分類及功能16-19
• 1.2 多殺性巴氏桿菌的研究進展19-31
• 1.2.1 多殺性巴氏桿菌的概況19-21
• 1.2.2 多殺性巴氏桿菌的主要毒力因子21-25
• 1.2.3 多殺性巴氏桿菌的疫苗研究25-31
• 第2章 引言31-33
• 2.1 研究目的及意義31
• 2.2 研究的主要內(nèi)容31-32
• 2.2.1 三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因Pm1g0001的生物信息學分析31
• 2.2.2 三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素編碼基因的分段表達及其表達產(chǎn)物Western-blot分析31-32
• 2.2.3 三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白Pm1g0001的功能研究32
• 2.3 技術路線32-33
• 第3章 三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因Pm1g0001生物信息學分析33-43
• 3.1 生物信息分析軟件33-34
• 3.1.1 結構域和跨膜結構域預測33
• 3.1.2 信號肽預測33
• 3.1.3 理化性質(zhì)分析33-34
• 3.1.4 抗原表位預測34
• 3.1.5 粘附功能區(qū)預測34
• 3.2 結果34-41
• 3.2.1 結構域和跨膜域預測結果34-35
• 3.2.2 信號肽分析結果35
• 3.2.3 理化性質(zhì)分析35-36
• 3.2.4 抗原表位分析36-41
• 3.2.5 粘附基序分析41
• 3.3 討論41-43
• 第4章 三聚體自轉(zhuǎn)運粘附素編碼基因的分段表達及其表達產(chǎn)物Western-blot分析43-59
• 4.1 材料43-46
• 4.1.1 菌株及質(zhì)粒43
• 4.1.2 主要試劑盒43
• 4.1.3 酶及主要生物試劑43-44
• 4.1.4 主要試劑的配制44-46
• 4.2 方法46-52
• 4.2.1 引物設計與合成46-47
• 4.2.2 模板DNA的提取47
• 4.2.3 目的基因的擴增47-48
• 4.2.4 擴增產(chǎn)物回收純化48
• 4.2.5 重組載體的構建48-50
• 4.2.6 目的基因的原核表達50-51
• 4.2.7 重組蛋白的純化51
• 4.2.8 重組蛋白Western-blot分析51-52
• 4.3 結果52-56
• 4.3.1 目的基因的擴增52
• 4.3.2 重組質(zhì)粒酶切驗證52-53
• 4.3.3 重組蛋白的誘導表達53-54
• 4.3.4 表達蛋白的純化54-55
• 4.3.5 重組蛋白Western-blot分析55-56
• 4.4 討論56-59
• 第5章 三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白Pm1g0001的功能研究59-71
• 5.1 材料59-61
• 5.1.1 菌種59
• 5.1.2 試驗動物59
• 5.1.3 試劑59
• 5.1.4 主要化學試劑的配制59-60
• 5.1.5 主要儀器60-61
• 5.2 方法61-63
• 5.2.1 小鼠攻毒保護試驗61-62
• 5.2.2 細胞粘附試驗62
• 5.2.3 生物膜試驗[193]62-63
• 5.3 結果63-68
• 5.3.1 抗體效價檢測63-64
• 5.3.2 小鼠免疫保護性試驗64-66
• 5.3.3 細胞粘附試驗66
• 5.3.4 生物膜形成試驗66-68
• 5.4 討論68-71
• 5.4.1 抗原表位與其免疫反應原性分析68-69
• 5.4.2 Pm1g0001蛋白功能區(qū)分析69-71
• 第6章 結論71-73
• 6.1 三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因Pm1g0001生物信息學分析71
• 6.2 三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的分段表達及其表達產(chǎn)物Western-blot分析71
• 6.3 三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白Pm1g0001蛋白功能研究71-73
• 參考文獻73-85
• 附表85-87
• 致謝87

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周索,楊振,劉婷,李素娟,尚忠林;植物異三聚體G蛋白[J];植物生理學通訊;2005年05期

2 郝立華;王偉霞;王靈敏;尚忠林;;植物異三聚體G蛋白在細胞信號轉(zhuǎn)導中的作用機制研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2009年04期

3 吳劉記;;組氨酸三聚體核苷結合蛋白研究進展[J];西北植物學報;2010年07期

4 尚忠林,馬力耕,王學臣,孫大業(yè);異三聚體G蛋白參與調(diào)節(jié)花粉細胞內(nèi)鈣離子濃度[J];自然科學進展;2003年07期

5 朱鶯;黃繼榮;;植物異三聚體G蛋白研究進展[J];植物生理學通訊;2010年04期

6 張?zhí)K娟;賀俊芳;王水才;羅志徽;陳暉;;假根羽藻外周天線三聚體超快熒光動力學研究[J];光子學報;2007年03期

7 馬力耕,毛國紅,崔素娟,孫大業(yè);花粉細胞中異三聚體G蛋白的檢測(快報)[J];河北師范大學學報;1997年02期

8 ;科學·集萃[J];科學新聞;2013年12期

9 趙發(fā)清,胡松年,閻隆飛;絲瓜的三聚體G蛋白的初步研究[J];中國生物化學與分子生物學報;1999年02期

10 楊振,劉婷,武延生,李建華,李冰,尚忠林;異三聚體G蛋白在擬南芥生長過程中的作用[J];河北師范大學學報;2005年03期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 肖麗娥;韓惠麗;何小榮;史庭云;;超球方法在惰性原子三聚體結構計算中的應用[A];第十五屆全國原子與分子物理學術會議論文摘要集[C];2009年

2 潘延云;呂麗敏;王志娟;;百合花粉磷脂酶C基因克隆及其與異三聚體G蛋白相互作用的分析[A];中國細胞生物學學會2005年學術大會、青年學術研討會論文摘要集[C];2005年

3 張偉;;異三聚體G蛋白參與調(diào)控擬南芥保衛(wèi)細胞鈣通道活性的實驗證據(jù)[A];2011全國植物生物學研討會論文集[C];2011年

4 張?zhí)K娟;王水才;賀俊芳;劉曉;陳暉;羅志徽;;假根羽藻LHCⅡ三聚體的瞬態(tài)差異吸收光譜研究[A];第六屆全國光生物學學術研討會論文集[C];2004年

5 張濤;趙修文;李博;張利國;張莉;;TDI三聚體溶液的合成及其在高回彈泡沫中的應用[A];中國聚氨酯工業(yè)協(xié)會第十七次年會論文集[C];2014年

6 吳曉霞;張園;王友華;梁建生;;異三聚體G-蛋白在擬南芥根系發(fā)育過程中的作用[A];長三角現(xiàn)代植物生物學與農(nóng)業(yè)專題論壇論文集[C];2005年

7 冷靜;姜桂珍;許亦農(nóng);李良璧;匡廷云;;菠菜LHCII中膜脂的組成及其對復合物聚集態(tài)影響的分析[A];全國植物光合作用、光生物學及其相關的分子生物學學術研討會論文摘要匯編[C];2001年

8 江健森;隋森芳;張雪峰;昌增益;;高溫條件下DegP三聚體的二維結晶及結構分析[A];第十三屆全國電子顯微學會議論文集[C];2004年

9 任一臻;黃真真;陳杰;黃長榮;;HDI三聚體產(chǎn)品難溶固體的分析[A];中國聚氨酯工業(yè)協(xié)會第十七次年會論文集[C];2014年

10 盧曉;陳政良;;MBL三聚體CRD制備與鑒定[A];中國免疫學會第四屆學術大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;新型涂料固化劑問世[N];今日信息報;2003年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 董哲;銅轉(zhuǎn)運蛋白的結構及在銀離子傳輸中的作用[D];吉林大學;2015年

2 徐小冬;異三聚體G蛋白在擬南芥花粉萌發(fā)及葉片發(fā)育過程中的作用（附：細胞外鈣調(diào)素與基因表達調(diào)控研究）[D];河北師范大學;2003年

3 王磊;三聚體自轉(zhuǎn)運黏附素Adh參與胸膜肺炎放線桿菌與宿主PAMs互作的機制研究[D];吉林大學;2015年

4 劉娜;1、EST3對tmTNF-α殺傷功能的影響及機制的初探 2、TmTNF-α保守序列與其三聚體化相關性研究[D];華中科技大學;2010年

5 彭菊芳;飛秒激光引發(fā)PSⅡ色素分子間的傳能動力學[D];中國科學院研究生院（西安光學精密機械研究所）;2004年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郭紀帥;甲苯二異氰酸酯三聚體預聚物的制備及其過程研究[D];華南理工大學;2015年

2 于一帆;甘藍型油菜異三聚體G蛋白功能研究[D];揚州大學;2015年

3 秦萬海;Apa2H1單聚體和三聚體抗原體外活化BMDCs和對小鼠免疫保護作用的比較[D];吉林大學;2016年

4 吉佳樂;牛源A型多殺性巴氏桿菌三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白功能研究[D];西南大學;2016年

5 李寬;異三聚體G蛋白下游效應器預測分析[D];福建農(nóng)林大學;2013年

6 鄭敏;異氰酸酯三聚體—含硫基硅氧烷復合物改性聚氨酯的研究[D];華中師范大學;2012年

7 寇正罡;二苯基甲烷二異氰酸酯三聚體的制備[D];北京化工大學;2010年

8 金超;高相容性甲苯二異氰酸酯三聚體的合成、性能及應用[D];華南師范大學;2005年

9 麥志遠;甲苯二異氰酸酯三聚體固化劑的制備與性能研究[D];華南理工大學;2013年

10 張圓;異三聚體G蛋白在生長素介導的擬南芥根系發(fā)育中的作用機理研究[D];揚州大學;2006年

，

本文編號：647129