本文關鍵詞：鴨PPAR基因家族功能分歧分析及啟動子克隆、活性調(diào)控元件篩選

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【摘要】：PPAR基因家族(PPARs)是調(diào)控脂肪酸及其衍生物等相關基因表達的一組受體,包括α、β(或δ)和γ三種亞型。在家禽上,PPARs被發(fā)現(xiàn)與皮下脂肪、肥肝和免疫抗逆等重要經(jīng)濟性狀有關,但PPARs在同一生物過程中的調(diào)控卻表現(xiàn)出功能上的差異。這些差異可能與PPARs的進化分歧和表達調(diào)控差異有關。本文擬對PPAR基因家族進化分歧進行分析,明確成員間的進化關系,了解家族成員功能產(chǎn)生分歧的可能原因,再通過分析鴨PPAR基因家族啟動子區(qū)的結構差異,篩選出與鴨PPARs差異調(diào)控相關的活性元件,并驗證部分活性元件與基因表達調(diào)控的關系。通過這些研究,為鴨PPARs基因表達調(diào)控,以及為PPARs調(diào)控禽類重要經(jīng)濟性狀形成的機制研究奠定基礎。研究結果表明：PPAR家族在魚類中先出現(xiàn)分歧,然后是兩棲類,接著是鳥類和哺乳類。進化樹顯示a、β、γ三種基因亞型出現(xiàn)明顯的分歧,其中γ與其它兩種亞型分歧較早。絕大部分物種PPARs氨基酸序列上都存在ZnF_C4和HOLI結構域。HOLI和ZnF_C4結構域的Ka/Ks值,以及啟動子調(diào)控元件數(shù)量,都支持a和β在進化上關系更近,γ更原始�？寺～@得的鴨PPARα、PPARβ和PPARγ啟動子片段長度分別為2526bp、1631bp和2942bp,與原雞同源性分別為70%、71%和75%。鴨PPARs啟動子區(qū)域內(nèi)存在典型的CAAT-box、TATA-box位點,無CpG島。構建了鴨PPARs各成員熒光素酶報告基因載體,其中α和β各7個,γ6個,細胞水平實驗篩選到鴨PPARa基因啟動子上游片段-150bp～-66bp和片段-1059bp～-876bp,以及β上游片段675bp～-540bp和｜上游片段-580bp～-360bp具有正向調(diào)控區(qū)域,在β上游片段-1267bp～-1036bp內(nèi)含有抑制轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)區(qū)域。啟動子活性區(qū)域分析,篩選出PPARs各成員共有3個轉(zhuǎn)錄因子,包括NF-1、Sp1和C/EBPa。NF-1、Spl、C/EBPα和PPARs在鴨胚胎期骨骼肌發(fā)育過程中的表達模式表明,3個轉(zhuǎn)錄因子在鴨胚胎骨骼肌發(fā)育中都有表達。雙向聚類分析發(fā)現(xiàn),Sp1與鴨PPARβ和PPARγ存在較高的同源性,NF-1與PPARa有較高同源性。NF-1可能是PPARα與其它2個家族成員功能分歧的原因之一,Sp1則可能導致PPARβ和PPARγ功能出現(xiàn)分歧。綜上所述,PPARγ可能是PPAR基因家族的原始祖先基因,PPARγ基因在進化過程中受到正選擇的程度是PPAR基因家族中最高的�？寺～@得的鴨PPARα、PPARβ和PPARγ啟動子片段長度分別為2526bp、1631bp和2942bp。篩選到鴨PPARα基因啟動子上游片段-150bp～-66bp和片段-1059bp～-876bp,以及β上游片段675bp～-540bp和γ上游片段-580bp～-360bp具有正向調(diào)控區(qū)域,在β上游片段-1267bp--1036bp內(nèi)含有抑制轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)區(qū)域。PARs各成員共有3個轉(zhuǎn)錄因子,包括NF-1、sp1和C/EBPa。Sp1與鴨PPARβ和PPARγ存在較高的同源性,NF-1與PPARa有較高同源性。NF-1是PPARα與其它2個家族成員功能分歧的原因之一,Sp1則導致PARβ和PPAR γ功能出現(xiàn)分歧。
【關鍵詞】：鴨 PPAR 基因家族 啟動子
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S834
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 主要符號說明9-14
• 前言14
• 1 文獻綜述14-25
• 1.1 PPAR基因家族的結構與功能14-17
• 1.1.1 PPAR基因家族組成及結構14-16
• 1.1.2 PPARs主要功能16-17
• 1.1.2.1 PPARs與糖脂代謝16
• 1.1.2.2 PPARs與脂肪細胞16-17
• 1.1.2.3 PPARs與成肌細胞17
• 1.1.2.4 PPARs與免疫17
• 1.2 PPAR基因家族成員間功能分歧及研究17-20
• 1.2.1 PPARs基因在脂肪細胞分化及脂質(zhì)代謝中的差異17-18
• 1.2.2 PPARs基因在胚胎發(fā)育過程中的差異18-19
• 1.2.3 PPAR基因家族分子進化19-20
• 1.3 PPARs與家禽重要經(jīng)濟性狀形成20-22
• 1.3.1 PPARs與禽類體脂沉積20-21
• 1.3.2 PPARs與禽類肉質(zhì)21
• 1.3.3 PPARs與肥肝21-22
• 1.4 PPARs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究進展22-24
• 1.4.1 啟動子及活性調(diào)控區(qū)域22
• 1.4.2 PPARs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究22-24
• 1.5 研究目的及意義24-25
• 2 材料與方法25-39
• 2.1 試驗材料25-27
• 2.1.1 樣品來源25
• 2.1.2 主要試劑盒及耗材25
• 2.1.3 試劑配制25-26
• 2.1.4 儀器設備26
• 2.1.5 相關分析軟件26-27
• 2.2 方法27-39
• 2.2.1 PPAR基因家族分子進化分析27-28
• 2.2.1.1 蛋白質(zhì)結構域27
• 2.2.1.2 進化樹構建27
• 2.2.1.3 氨基酸選擇壓力27
• 2.2.1.4 轉(zhuǎn)錄因子27-28
• 2.2.2 鴨基因組DNA的提取和檢測28
• 2.2.2.1 鴨肌肉組織中的DNA提取28
• 2.2.2.2 檢測所提取的DNA質(zhì)量28
• 2.2.3 鴨PPARs基因啟動子區(qū)擴增28-30
• 2.2.3.1 設計所要擴增的鴨PPARs基因啟動子引物28-29
• 2.2.3.2 PCR擴增目的片段29
• 2.2.3.3 回收凝膠并純化PCR產(chǎn)物29
• 2.2.3.4 回收純化的目的片段與T載體連接29-30
• 2.2.3.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化30
• 2.2.3.6 陽性克隆及測序鑒定30
• 2.2.4 鴨PPARs基因啟動子的生物信息學分析30-31
• 2.2.5 含有鴨PPARs基因啟動子的熒光素酶報告基因載體的構建31-33
• 2.2.5.1 啟動子5’遞減片段的熒光素酶報告基因載體構建引物計31
• 2.2.5.2 遞減片段的PCR擴增31-32
• 2.2.5.3 PCR產(chǎn)物的純化和回收及克隆和測序32
• 2.2.5.4 重組質(zhì)粒DNA的提取32
• 2.2.5.5 重組質(zhì)粒雙酶切和產(chǎn)物純化回收32-33
• 2.2.5.6 pGL3-basic與PPARs重組載體構建33
• 2.2.5.7 重組pGL3-basic-PPARs載體克隆及測序33
• 2.2.6 鴨PPARs基因啟動子核心區(qū)域的鑒定33-35
• 2.2.6.1 無內(nèi)毒素質(zhì)粒pGL3-basic-PPARs的提取33-34
• 2.2.6.2 HEK293細胞培養(yǎng)34
• 2.2.6.3 重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染34
• 2.2.6.4 熒光素酶報告基因活性檢測34-35
• 2.2.6.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析35
• 2.2.7 鴨PPARs基因啟動子活性調(diào)控元件篩選35-39
• 2.2.7.1 RNA提取及檢測35
• 2.2.7.2 cDNA合成35-37
• 2.2.7.3 定量引物設計37
• 2.2.7.4 qRT-PCR檢測37-39
• 3 結果與分析39-59
• 3.1 PPAR基因家族分子進化分析39-47
• 3.1.1 蛋白質(zhì)結構域關系39-41
• 3.1.2 PPAR基因家族的蛋白質(zhì)進化樹41-42
• 3.1.3 氨基酸位點選擇壓力分析42-46
• 3.1.4 5’端啟動子區(qū)域?qū)D(zhuǎn)錄因子結合位點46-47
• 3.2 鴨PPARs基因啟動子區(qū)擴增47-52
• 3.2.1 鴨PPARs啟動子克隆及同源性比對47-48
• 3.2.2 鴨PPARs啟動子序列特點48-52
• 3.3 鴨PGL3-BASIc-PPARs重組載體的構建52-53
• 3.4 鴨PPARs啟動子活性調(diào)控區(qū)域鑒定53-56
• 3.4.1 熒光素酶相對活性檢測53-54
• 3.4.2 鴨PPARs基因啟動子活性區(qū)域比較54-56
• 3.5 鴨PPARs基因啟動子活性調(diào)控元件驗證56-59
• 4 討論59-64
• 4.1 PPAR基因家族分子進化與調(diào)控59-61
• 4.2 鴨PPARs基因啟動子序列特點61-62
• 4.3 鴨PPARs的活性調(diào)控元件異同62-64
• 5 結論64-66
• 參考文獻66-75
• 致謝75-76
• 附件76-82
• 研究生期間發(fā)表的文章82

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：636206