本文關(guān)鍵詞：豬FTO原核表達(dá)及其對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響

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【摘要】：脂肪量和肥胖相關(guān)基因(fat mass and obesity-related gene, FTO)是近幾年發(fā)現(xiàn)的能影響機(jī)體脂肪沉積的新基因,其單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與豬肉質(zhì)性狀指標(biāo)呈顯著正相關(guān),揭示該基因可能是影響豬肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因。為探究該基因?qū)?nèi)脂肪沉積的影響,本研究通過原核表達(dá)得到豬FTO重組蛋白,并制備其多克隆抗體以探討豬FTO組織表達(dá)規(guī)律及其在細(xì)胞中的定位,同時(shí)以豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞為研究對象,探討FTO基因?qū)ωi肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響,主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：1豬FTO基因的原核表達(dá)以提取的豬背最長肌總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板克隆出豬FTO基因,將其插入到原核表達(dá)載體pET30a(+)中,獲得的重組質(zhì)粒命名為pET30a(+)-pFTO。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),同時(shí)優(yōu)化其誘導(dǎo)表達(dá)條件,通過SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物,隨后用Ni2+-IDA親和層析柱純化后進(jìn)行western blot鑒定。結(jié)果表明,重組蛋白在30 ℃C經(jīng)0.75mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h達(dá)最佳表達(dá),表達(dá)蛋白分子量約56 kDa。純化的重組蛋白能被抗組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體特異性識別,揭示本試驗(yàn)成功獲得了高純度的FTO重組蛋白。2豬FTO組織表達(dá)規(guī)律及亞細(xì)胞定位研究以純化的FTO重組蛋白多次免疫昆明小鼠制備多克隆抗體。多克隆抗體的效價(jià)和特異性分別用間接ELISA和western blot鑒定；進(jìn)一步用制備的FTO多克隆抗體檢測FTO蛋白在10周齡DLY豬背最長肌、趾長伸肌、比目魚肌、腰大肌、腹部脂肪、肝臟、肺、腎臟和心臟等組織中的表達(dá)情況：另外,用酶解法從3日齡DLY豬背最長肌中分離肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測成脂相關(guān)基因如脂聯(lián)素、PPARγ和C/EBPa的表達(dá)變化,同時(shí)用油紅0染色檢測脂滴生成情況。并進(jìn)一步采用免疫熒光分析FTO在豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中的定位。結(jié)果表明,制備的FTO多克隆抗體滴度達(dá)1：40960,且該多克隆抗體能夠特異性識別FTO重組蛋白。FTO蛋白主要表達(dá)于脂肪和肺臟組織,肝臟和肌肉中有少量的表達(dá)。另外,本試驗(yàn)分離出的豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞能高表達(dá)成脂相關(guān)基因并能分化為成熟的脂肪細(xì)胞,且FTO主要定位于細(xì)胞核。揭示本實(shí)驗(yàn)成功制備了豬FTO多克隆抗體及分離了豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞。FTO主要定位于細(xì)胞核,且其與脂肪沉積有關(guān)。3 FTO對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響通過過表達(dá)或siRNA干擾處理豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞,采用EdU增殖分析和western blot檢測phospho-Histone H3蛋白表達(dá)探討FTO對豬肌內(nèi)前體脂肪-細(xì)胞增殖的影響。同時(shí)在豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)FTO或siRNA干擾FTO,誘導(dǎo)分化8d后進(jìn)行油紅O和甘油三酯檢測脂滴生成情況,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和western blot檢測脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,過表達(dá)FTO能顯著提高EdU陽性細(xì)胞增殖率并顯著上調(diào)phospho-HistoneH3蛋白表達(dá),而siRNA干擾FTO得到相反的結(jié)果。另外,過表達(dá)FTO能促進(jìn)脂滴生成,同時(shí)能顯著上調(diào)PPARγ、C/EBPa和LPL等脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)以及PPARy和C/EBPa的蛋白表達(dá),且siRNA干擾FTO得到相反的結(jié)果。以上結(jié)果表明FTO能顯著促進(jìn)豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化。綜上所述,本研究通過原核表達(dá)獲得了高純度的豬FTO重組蛋白并制備了其多克隆抗體；FTO蛋白主要表達(dá)于脂肪組織,肝臟和肌肉中也有少量表達(dá),且FTO主要定位于細(xì)胞核；細(xì)胞試驗(yàn)證明FTO能顯著促進(jìn)豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化。這些結(jié)果揭示FTO可能是影響豬肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因。
【關(guān)鍵詞】：豬FTO 原核表達(dá) 組織表達(dá)規(guī)律 豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞 增殖和分化
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 主要縮略詞10-13
• 前言13-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-19
• 1 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)及其增殖分化概況14-15
• 1.1 肌內(nèi)脂肪與肉質(zhì)14
• 1.2 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)14
• 1.3 脂肪細(xì)胞的增殖和分化14-15
• 2 FTO基因研究現(xiàn)狀15-19
• 2.1 FTO基因的發(fā)現(xiàn)15-16
• 2.2 FTO的結(jié)構(gòu)及定位16
• 2.3 FTO的分布及表達(dá)16-17
• 2.4 FTO與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)性17
• 2.5 FTO與脂肪沉積17-19
• 第二章 本研究的目的、意義、內(nèi)容和技術(shù)路線19-21
• 1 研究目的及意義19
• 2 研究內(nèi)容19-20
• 3 技術(shù)路線20-21
• 第三章 試驗(yàn)研究21-56
• 試驗(yàn)一 豬FTO基因的原核表達(dá)21-34
• 1 引言21
• 2 試驗(yàn)材料21-24
• 2.1 菌株、載體、細(xì)胞系、試驗(yàn)動(dòng)物和飼料21
• 2.2 酶和試劑21-22
• 2.3 培養(yǎng)基和常見化學(xué)試劑配制22-23
• 2.4 使用儀器23-24
• 3 試驗(yàn)方法24-27
• 3.1 豬FTO基因的克隆及鑒定24
• 3.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定24-26
• 3.3 豬FTO在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和鑒定26-27
• 4 試驗(yàn)結(jié)果與分析27-32
• 4.1 豬FTO原核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定27-29
• 4.2 豬FTO重組蛋白原核表達(dá)29-32
• 5 討論32-33
• 6 小結(jié)33-34
• 試驗(yàn)二 豬FTO組織表達(dá)規(guī)律及亞細(xì)胞定位研究34-45
• 1 引言34
• 2 試驗(yàn)材料34-35
• 2.1 試驗(yàn)動(dòng)物34
• 2.2 酶和試劑34-35
• 2.3 培養(yǎng)基和常見化學(xué)試劑配制35
• 2.4 試驗(yàn)儀器35
• 3 試驗(yàn)方法35-39
• 3.1 重組蛋白多克隆抗體制備及鑒定35-36
• 3.2 豬FTO在DLY豬中的組織表達(dá)規(guī)律36-37
• 3.3 豬FTO在豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中的定位37-39
• 3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析39
• 4 試驗(yàn)結(jié)果及分析39-42
• 4.1 多克隆抗體制備和鑒定39-40
• 4.2 FTO組織表達(dá)規(guī)律檢測40-41
• 4.3 豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分離鑒定41-42
• 4.4 FTO在豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中的定位42
• 5 討論42-44
• 6 小結(jié)44-45
• 試驗(yàn)三 豬FTO對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響45-56
• 1 引言45
• 2 試驗(yàn)材料45-46
• 2.1 載體45
• 2.2 酶和試劑45
• 2.3 培養(yǎng)基和常見化學(xué)試劑配制45-46
• 2.4 使用儀器46
• 3 試驗(yàn)方法46-49
• 3.1 真核載體pcDNA3.1(+)-pFTO的構(gòu)建及鑒定46-47
• 3.2 豬FTO基因siRNA的設(shè)計(jì)及其沉默效果檢測47
• 3.3 豬FTO對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖的影響47-48
• 3.4 豬FTO對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的影響48
• 3.5 數(shù)據(jù)處理及分析48-49
• 4 試驗(yàn)結(jié)果49-54
• 4.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定49-50
• 4.2 豬FTO基因siRNA沉默效果檢測50
• 4.3 豬FTO對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖的影響50-52
• 4.4 豬FTO對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的影響52-54
• 5 討論54-55
• 6 小結(jié)55-56
• 第四章 全文總結(jié)56-57
• 1 本研究主要結(jié)論56
• 2 本研究主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)56
• 3 有待于進(jìn)一步研究的問題56-57
• 參考文獻(xiàn)57-66
• 致謝66-67
• 個(gè)人簡歷67

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：619438