本文關(guān)鍵詞：一株可裂解大腸桿菌和沙門氏菌的噬菌體基因組學(xué)分析及其裂解酶活性鑒定

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【摘要】：大腸桿菌和沙門氏菌是兩種重要的人畜共患病的病原,在世界范圍內(nèi)已經(jīng)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失并嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全。隨著抗生素的大量和不合理使用,這兩種細(xì)菌的多重耐藥菌株層出不窮,使得新型有效抗菌制劑的開發(fā)迫在眉睫。由于噬菌體及其裂解酶與細(xì)菌長期共同進(jìn)化,且具有高效殺菌活性,因此這兩者作為新的抗生素替代物或者是對抗生素的一種補(bǔ)充得到科學(xué)界的重視。本研究旨在分離鑒定針對大腸桿菌和沙門氏菌的多價(jià)噬菌體,并獲取其裂解酶,試圖開發(fā)針對這兩種致病菌的新型抗菌制劑。本研究以一株臨床分離的豬源大腸桿菌為宿主菌,從污水中分離純化到一株烈性噬菌體,命名為ECGD1。用磷鎢酸負(fù)染法觀察其形態(tài),并進(jìn)一步測定其最佳感染復(fù)數(shù)及宿主譜。對ECGD1進(jìn)行全基因序列測定,利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行基因預(yù)測和功能注釋,并通過全基因組序列比對分析ECGD1與相關(guān)噬菌體的進(jìn)化關(guān)系。通過基因組學(xué)分析,預(yù)測ECGD1裂解酶基因,利用基因工程手段進(jìn)行體外表達(dá),并進(jìn)一步鑒定表達(dá)產(chǎn)物的裂解活性及與多粘菌素B的協(xié)同抑菌效果。結(jié)果顯示:(1)大腸桿菌噬菌體ECGD1可形成透明、邊緣清晰的噬菌斑;電鏡下觀察到ECGD1具有典型的二十面體頭部和伸縮性的尾部,尾部附有一簇尾絲,屬于有尾噬菌體目,肌尾噬菌體科;最佳感染復(fù)數(shù)為10-3;通過宿主譜測定,發(fā)現(xiàn)ECGD1是一株寬裂解譜噬菌體,可裂解臨床分離的6株大腸桿菌(6/12)和17株沙門氏菌(17/26),同時(shí)還可裂解大腸桿菌基因工程菌株DH5α和BL21。(2)通過基因組測序及分析,發(fā)現(xiàn)ECGD1基因組全長146 647 bp,平均GC含量為37.5%,包含11個(gè)tRNA和2個(gè)pseudo-tRNA基因;共預(yù)測出234個(gè)CDS,78個(gè)被賦予假定的功能,另外156個(gè)功能未知。已賦予功能的CDS,可分為核苷酸代謝/DNA復(fù)制/重組、基因組包裝、結(jié)構(gòu)蛋白基因、裂解基因和其它功能基因等五大類;全基因組比對發(fā)現(xiàn),ECGD1與大腸桿菌噬菌體phi92同源性很高,屬于rv-5 like屬的成員。(3)本試驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)裂解酶的重組質(zhì)粒pET-32a-lysin,在BL21(DE3)中成功表達(dá)出了裂解酶重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析該表達(dá)產(chǎn)物主要為可溶性蛋白,且表達(dá)量較高;經(jīng)過活性鑒定,發(fā)現(xiàn)該重組蛋白具有菌內(nèi)及菌外裂解活性;且該重組蛋白與多粘菌素B的聯(lián)用降低了多粘菌素B的最低抑菌濃度。綜上所述,本研究分離的ECGD1是肌尾噬菌體科rv-5 like屬的成員,是一株寬裂解譜的噬菌體,且經(jīng)體外表達(dá)的裂解酶初步鑒定具有殺菌效果,因此,噬菌體ECGD1及其裂解酶在大腸桿菌和沙門氏菌感染的防控上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：大腸桿菌 沙門氏菌 噬菌體 基因組學(xué) 裂解酶
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文縮略詞7-11
• 1 前言11-16
• 1.1 大腸桿菌簡介11
• 1.2 沙門氏菌簡介11-12
• 1.3 噬菌體及噬菌體治療12-13
• 1.4 噬菌體裂解酶及裂解酶治療13-15
• 1.5 本研究目的與意義15-16
• 2 材料與方法16-29
• 2.1 試驗(yàn)材料16-18
• 2.1.1 菌種與質(zhì)粒16
• 2.1.2 主要試劑與藥品16-17
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備17-18
• 2.2 噬菌體的分離、鑒定及部分生物學(xué)特性分析18-19
• 2.2.1 噬菌體的分離純化18
• 2.2.2 噬菌體形態(tài)的電鏡觀察18
• 2.2.3 噬菌體懸液效價(jià)的測定18-19
• 2.2.4 噬菌體ECGD1的最佳感染復(fù)數(shù)的測定19
• 2.2.5 噬菌體宿主范圍的測定19
• 2.3 噬菌體ECGD1的基因組學(xué)分析19-22
• 2.3.1 噬菌體擴(kuò)繁濃縮及基因組的提取19-20
• 2.3.2 噬菌體全基因組測序20
• 2.3.3 噬菌體功能基因組學(xué)分析20-21
• 2.3.4 裂解酶基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測21-22
• 2.4 噬菌體ECGD1裂解酶lysin的表達(dá)及活性鑒定22-29
• 2.4.1 裂解酶基因lysin的引物設(shè)計(jì)和基因擴(kuò)增22
• 2.4.2 裂解酶基因PCR產(chǎn)物回收22-23
• 2.4.3 裂解酶基因PCR產(chǎn)物與pET-32a的雙酶切23
• 2.4.4 裂解酶基因PCR產(chǎn)物與pET-32a的雙酶切產(chǎn)物的連接23-24
• 2.4.5 重組質(zhì)粒pET-32a-lysin的制備24-25
• 2.4.6 重組質(zhì)粒pET-32a-lysin轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞25
• 2.4.7 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)25
• 2.4.8 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析25-26
• 2.4.9 目的蛋白的純化及濃度測定26-27
• 2.4.10 表達(dá)產(chǎn)物裂解活性的檢測27-28
• 2.4.10.1 菌內(nèi)裂解活性的檢測27
• 2.4.10.2 菌外裂解活性的檢測27-28
• 2.4.11 表達(dá)產(chǎn)物裂解譜的測定28
• 2.4.12 多粘菌素B與重組蛋白聯(lián)用裂解活菌28-29
• 3 結(jié)果與分析29-57
• 3.1 噬菌體分離、鑒定及部分生物學(xué)特性29-32
• 3.1.1 噬菌體分離29
• 3.1.2 噬菌體ECGD1的形態(tài)29-30
• 3.1.3 噬菌體ECGD1效價(jià)測定30-31
• 3.1.4 噬菌體ECGD1的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）31
• 3.1.5 噬菌體ECGD1的宿主范圍31-32
• 3.2 噬菌體ECGD1全基因組序列測定及分析32-48
• 3.2.1 噬菌體基因組一般特性分析32
• 3.2.2 噬菌體基因組tRNA分析32-33
• 3.2.3 噬菌體基因組基因預(yù)測與功能注釋33-44
• 3.2.3.1 核苷酸代謝/DNA復(fù)制/重組相關(guān)基因34-43
• 3.2.3.2 基因組包裝相關(guān)基因43
• 3.2.3.3 結(jié)構(gòu)蛋白基因43
• 3.2.3.4 裂解基因43
• 3.2.3.5 其它功能基因43
• 3.2.3.6 有害基因篩查結(jié)果43-44
• 3.2.4 噬菌體基因組比較分析44-45
• 3.2.5 裂解酶基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果45-48
• 3.2.5.1 結(jié)構(gòu)域預(yù)測45
• 3.2.5.2 跨膜區(qū)域預(yù)測45-46
• 3.2.5.3 信號肽預(yù)測46-47
• 3.2.5.4 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果47
• 3.2.5.5 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果47-48
• 3.3 噬菌體ECGD1裂解酶lysin的表達(dá)及活性鑒定48-57
• 3.3.1 裂解酶基因lysin的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定48-49
• 3.3.2 裂解酶lysin誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析49-51
• 3.3.3 裂解酶lysin純化51
• 3.3.4 裂解酶lysin裂解活性鑒定51-54
• 3.3.4.1 裂解酶lysin菌內(nèi)裂解活性檢測51-52
• 3.3.4.2 裂解酶lysin菌外裂解活性檢測52-54
• 3.3.5 裂解酶lysin裂解譜測定54-56
• 3.3.6 裂解酶lysin與多粘菌素B協(xié)同作用效果56-57
• 4 討論57-63
• 4.1 噬菌體生物學(xué)特性的探討57-58
• 4.2 噬菌體基因組學(xué)探討58-60
• 4.3 裂解酶表達(dá)的探討60-61
• 4.4 裂解酶活性鑒定的探討61-62
• 4.5 裂解酶與多粘菌素B協(xié)同作用的探討62-63
• 5 結(jié)論63-64
• 致謝64-65
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 碩士期間所獲獎勵(lì)與發(fā)表文章70

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 任慧婧;譚艾娟;呂世明;劉蕓;劉玉梅;張家俊;胡美忠;;市售雞肉中沙門氏菌的污染及耐藥性研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2016年03期

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本文編號：615965