本文關(guān)鍵詞：雛鴨感染DRV后炎性相關(guān)因子與脾損傷間的動(dòng)態(tài)關(guān)系

  更多相關(guān)文章： 鴨呼腸孤病毒 炎癥反應(yīng) 多克隆抗體 脾損傷 雙鏈RNA激活蛋白激酶

【摘要】：鴨呼腸孤病毒病是由鴨呼腸孤病毒(Duck reovirus,DRV)引起的以脾表面出現(xiàn)黃白色壞死灶,法氏囊萎縮為主要特征的一種急性傳染病,該病毒可感染雛鴨和雞,繼發(fā)感染其他病原引起動(dòng)物死亡,給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前關(guān)于哺乳動(dòng)物脾損傷的機(jī)制研究已逐步深入,研究結(jié)果表明PKR在各種損傷過程中發(fā)揮著重要作用。但是關(guān)于鴨PKR介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)還未見報(bào)道,且是否參與DRV引起脾損傷的進(jìn)程還不清楚。因此研究PKR在脾損傷中的作用是很有必要的。本研究通過建立人工感染模型,探討PKR介導(dǎo)的炎癥信號通路在DRV感染雛鴨致脾損傷中的作用。主要包括以下幾個(gè)方面:1.DuTNF-α多克隆抗體的制備本實(shí)驗(yàn)以雛鴨脾組織的RNA為模板,利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增DuTNF-α基因,克隆至pET-28a載體上,經(jīng)過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定測序分析正確后,獲得重組質(zhì)粒pET-28a-DuTNF-α,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta中,在IPTG終濃度1mmol/L和37℃條件下誘導(dǎo)4h,外源基因獲得高效表達(dá)。通過Ni柱對蛋白進(jìn)行純化,純化后的DuTNF-α蛋白免疫新西蘭大耳白兔,經(jīng)三次免疫后取全血,分離得到DuTNF-α多克隆抗體。利用Elisa和免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果表明多克隆抗體有較好的反應(yīng)原性。2.建立DRV感染7日齡櫻桃谷鴨模型分別在雛鴨感染后1d、3d、5d、7d、14d剖殺取脾組織。從組織形態(tài)學(xué)判定脾損傷程度,采用組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)判定炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。利用RT-qPCR技術(shù)檢測感染后脾中PKR、MKK6、AP-1、IPS-1、NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化,并分別取5個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對照組的脾臟石蠟切片,每組各取三個(gè)重復(fù)樣品進(jìn)行免疫組化,使用數(shù)字切片掃描儀將切片掃描,使用單位面積陽性率進(jìn)行結(jié)果分析。眼觀病變發(fā)現(xiàn),感染后1d、3d脾顯著腫大,顏色逐漸加深,部分病灶呈暗黑色,感染5d后脾顏色恢復(fù)正常,脾表明可見明顯大小不一的黃白色病灶。組織病理學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染后3d脾出血嚴(yán)重,白髓淋巴細(xì)胞明顯減少,感染后5d脾臟可見明顯的壞死灶,壞死灶與周圍健康細(xì)胞分界明顯,感染7d后可見明顯的肉芽腫結(jié)構(gòu)。根據(jù)Opriessning T的評定標(biāo)準(zhǔn)對脾組織學(xué)病理損傷進(jìn)行評定發(fā)現(xiàn)感染3d后出血嚴(yán)重,感染5d后發(fā)生壞死,感染7d后形成肉芽腫結(jié)構(gòu)。用DRV特異性抗體及炎癥細(xì)胞特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,證明脾產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。熒光定量檢測脾中PKR介導(dǎo)的炎癥信號通路相關(guān)因子的表達(dá)量,結(jié)果顯示PKR在感染后1d、3d、5d處于上調(diào)表達(dá),且5d達(dá)到峰值,7d、14d與5d試驗(yàn)組相比差異顯著(P0.05),這與病毒的表達(dá)量呈正相關(guān),說明PKR可能參與dsRNA的識別,從而激活下游因子引起脾臟損傷。MKK6、AP-1、IPS-1在感染過程中均無上調(diào)表達(dá),而NF-κB在整個(gè)感染過程中一直處于上調(diào)表達(dá)�？梢娫贒RV感染雛鴨后PKR參與病毒的識別,并激活NF-κB入核啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子。下游炎癥因子TNF-α表達(dá)趨勢與NF-κB一致,IL-6在感染3d后上調(diào)表達(dá),到7d達(dá)到峰值,說明TNF-α與IL-6參與脾炎癥反應(yīng)。免疫組化統(tǒng)計(jì)結(jié)果說明在感染過程中TNF-α蛋白上調(diào)表達(dá),第5d達(dá)到最高,這與熒光定量結(jié)果相符。結(jié)論:DRV感染雛鴨脾臟結(jié)構(gòu)和功能均受到影響,脾臟PKR炎癥信號通路被激活且激活狀態(tài)與脾損傷的程度相關(guān)。炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6在感染后顯著升高,提示PKR炎癥信號通路以及TNF-α、IL-6的表達(dá)參與DRV致脾損傷。
【關(guān)鍵詞】：鴨呼腸孤病毒 炎癥反應(yīng) 多克隆抗體 脾損傷 雙鏈RNA激活蛋白激酶
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.32
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略語表(Abbreviation)12-13
• 前言13-20
• 1 鴨呼腸孤病毒的研究進(jìn)展13-14
• 2 雙鏈RNA激活蛋白激酶14-18
• 2.1 PKR概述14-16
• 2.1.1 PKR的抑制蛋白翻譯的作用15
• 2.1.2 PKR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡15
• 2.1.3 PKR誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)15-16
• 2.2 PKR介導(dǎo)的炎癥信號通路16-18
• 2.2.1 PKR介導(dǎo)的MAPKs炎癥反應(yīng)16
• 2.2.2 PKR介導(dǎo)的NF-κB信號通路16-17
• 2.2.3 PKR介導(dǎo)的IPS-1 信號通路17-18
• 3 鴨腫瘤壞死因子 α 概述18-20
• 3.1 禽類炎性相關(guān)因子的概述18
• 3.2 鴨腫瘤壞死因子18-19
• 3.3 TNF-α 在脾炎癥中的作用19-20
• 研究目的及意義20-21
• 材料與方法21-37
• 1 材料21-24
• 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、毒株、抗體及表達(dá)相關(guān)材料21
• 1.2 主要儀器設(shè)備21-22
• 1.3 主要試劑22
• 1.4 主要試劑配制22-24
• 1.4.1 RNA提取相關(guān)試劑22
• 1.4.2 細(xì)菌培養(yǎng)、蛋白表達(dá)純化相關(guān)試劑22-24
• 1.4.3 ELISA相關(guān)試劑24
• 1.4.4 透析袋的處理24
• 2 試驗(yàn)方法24-37
• 2.1 DuTNF-α 多克隆抗體的制備24-29
• 2.1.1 DuTNF-α 基因的PCR引物設(shè)計(jì)24
• 2.1.2 RT-PCR對目的基因的擴(kuò)增24-25
• 2.1.3 PCR產(chǎn)物的回收25-26
• 2.1.4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建26-27
• 2.1.5 重組質(zhì)粒的提取與鑒定27-28
• 2.1.6 重組蛋白的表達(dá)與鑒定28-29
• 2.1.7 重組蛋白的純化與復(fù)性29
• 2.1.8 免疫方案29
• 2.2 多克隆抗體DuTNF-α 的鑒定29-30
• 2.2.1 間接ELISA檢測血清免疫原性29-30
• 2.2.2 DuTNF-α 在肝、脾免疫組織化學(xué)鑒定30
• 2.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理30
• 2.4 試驗(yàn)樣品的采集與保存30
• 2.5 感染JZ061214株DRV雛鴨的組織學(xué)病理變化動(dòng)態(tài)觀察30-31
• 2.6 鴨呼腸孤病毒及巨噬細(xì)胞在脾組織中的定位31-32
• 2.7 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測雛鴨脾PKR介導(dǎo)的炎癥信號通路相關(guān)因子及炎性因子mRNA的表達(dá)量32-35
• 2.7.1 組織總RNA的提取32
• 2.7.2 引物的設(shè)計(jì)32-33
• 2.7.3 RT- PCR擴(kuò)增檢測脾PKR、MKK6、AP-1 和IPS-1 基因33-34
• 2.7.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增目的基因34-35
• 2.8 脾臟中TNF-α 的免疫組化定量分析35-36
• 2.9 數(shù)據(jù)分析36-37
• 試驗(yàn)結(jié)果37-54
• 1 DuTNF-α 多克隆抗體的制備37-41
• 1.1 DuTNF-α 的克隆37
• 1.2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建37-38
• 1.3 DuTNF-α 基因序列分析38-39
• 1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-TNF-α 的酶切鑒定39
• 1.5 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物鑒定與純化39-40
• 1.6 重組蛋白的Western-bolt鑒定40-41
• 2 多克隆抗體的制備與反應(yīng)原性檢測41-42
• 2.1 免疫兔血清抗體效價(jià)的測定41
• 2.2 免疫組化檢測DuTNF-α 的反應(yīng)原性41-42
• 3 雛鴨感染JZ061214株DRV的臨床表現(xiàn)與眼觀病變42-43
• 4 JZ061214株DRV感染雛鴨的組織學(xué)病理變化結(jié)果43-45
• 5 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測脾病毒的組織分布45-46
• 6 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測脾炎癥反應(yīng)46-47
• 7 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測雛鴨脾PKR介導(dǎo)的炎癥信號通路相關(guān)因子及炎性因子mRNA的表達(dá)量47-52
• 7.1 實(shí)時(shí)熒光定量檢測目的基因結(jié)果47
• 7.2 RT-qPCR檢測脾PKR、MKK6、AP-1、IPS-1、NF-κB、TNF-α、IL-6 的mRNA表達(dá)量結(jié)果47-52
• 8 TNF-α 在脾中的表達(dá)檢測52-54
• 討論54-58
• 1 DuTNF-α 克隆表達(dá)與多克隆抗體的制備54
• 2 JZ株061214株DRV感染雛鴨的臨床癥狀和脾臟病理變化的動(dòng)態(tài)觀察54-55
• 3 炎癥反應(yīng)在DRV引起脾損傷中的作用55-58
• 3.1 DRV感染雛鴨后脾炎癥反應(yīng)檢測55
• 3.2 PKR介導(dǎo)的炎癥信號通路在脾損傷中的作用55-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 致謝66

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本文編號：580535