本文關(guān)鍵詞：p53在PCV2誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯中的調(diào)控作用

  更多相關(guān)文章： 豬圓環(huán)病毒2型 p53基因敲除 病毒感染 細(xì)胞周期阻滯

【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬,為無囊膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒,是引起以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征為主要特征的豬圓環(huán)病毒病的主要病原。PCV2感染宿主細(xì)胞后,常會影響宿主細(xì)胞周期和誘導(dǎo)部分宿主細(xì)胞凋亡。作為細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)控基因,p53在上述過程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,但在PCV2感染宿主細(xì)胞過程中,p53具體通過什么途徑對細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控,目前還不清楚。本試驗(yàn)以豬腎源性PK-15細(xì)胞為模式細(xì)胞,運(yùn)用靶向于豬p53基因的CRISPR-Cas9慢病毒系統(tǒng)感染PK-15細(xì)胞,嘌呤霉素篩選陽性克隆細(xì)胞,篩選獲得p53基因敲除的PK-15細(xì)胞,以不同病毒滴度的PCV2感染野生型和p53基因敲除的PK-15細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞基因組測序和western blotting等方法檢測p53基因敲除對PCV2感染細(xì)胞的細(xì)胞周期和周期調(diào)控分子的影響。研究取得如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.利用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)成功構(gòu)建了兩株p53基因修飾細(xì)胞。在靶向于p53基因148位點(diǎn)構(gòu)建的p53基因敲除的細(xì)胞中,p53基因的225堿基位點(diǎn)處插入一個堿基A,使得p53蛋白第47位的絲氨酸變成丙氨酸,并導(dǎo)致其在第54位移碼終止;而在靶向于p53基因813位點(diǎn)構(gòu)建的p53基因敲除的細(xì)胞中,p53基因的561、562和564堿基位點(diǎn)處分別缺失堿基C、堿基A和堿基G,導(dǎo)致突變。即靶向于148位點(diǎn)構(gòu)建的PK-15細(xì)胞為p53基因敲除PK-15細(xì)胞,而靶向于813位點(diǎn)構(gòu)建的PK-15細(xì)胞為p53基因突變PK-15細(xì)胞。Western blotting檢測結(jié)果顯示,靶向于p53基因148位點(diǎn)構(gòu)建的敲除細(xì)胞檢測不到p53蛋白的表達(dá),而靶向于p53基因813位點(diǎn)構(gòu)建的敲除細(xì)胞,其p53蛋白表達(dá)量與野生型PK-15細(xì)胞的p53表達(dá)量相比下降了20%左右。2.PCV2感染同步化和非同步化的PK-15細(xì)胞后,均可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在S期,PCV2誘導(dǎo)的S期阻滯依賴于其自身的復(fù)制,同時大量細(xì)胞停留在S期顯著地促進(jìn)了病毒的復(fù)制。PCV2感染上調(diào)p53和p21的蛋白表達(dá),顯著降低CDK2和Cyclin A的表達(dá),顯著提高Cyclin E的表達(dá)。3.PCV2分別感染野生型PK-15細(xì)胞,p53敲除的PK-15(148PK-15p53-/-)細(xì)胞和p53突變的PK-15(813PK-15p53m/m)細(xì)胞,細(xì)胞周期檢測顯示,在野生型PK-15細(xì)胞中,PCV2感染組S期細(xì)胞的數(shù)目顯著增多(p0.05),約為對照感染組的1.3倍;在148PK-15p53-/-細(xì)胞中,PCV2感染組和模擬感染組間S期細(xì)胞群體比例沒有顯著差異;在813PK-15p53m/m細(xì)胞中,PCV2感染組S期細(xì)胞群體比例輕度增加;PCV2在野生型PK-15細(xì)胞中以一種緩慢增殖的方式進(jìn)行復(fù)制;在813PK-15p53m/m細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)和野生型PK-15細(xì)胞相比,差異并不顯著;而PCV2感染148PK-15p53-/-細(xì)胞24 h后,病毒拷貝數(shù)顯著低于野生型PK-15細(xì)胞(p0.05);PCV2感染148PK-15p53-/-細(xì)胞后,其下游因子p21蛋白未被檢測到,Cyclin A、CDK2和Cyclin E的表達(dá)量均維持在一個相對穩(wěn)定的水平,并沒有在PCV2感染后減少或者增多。而PCV2感染813PK-15p53m/m細(xì)胞后,其下游因子p21蛋白表達(dá)被上調(diào),Cyclin A和CDK2蛋白表達(dá)量減少,但是與野生型細(xì)胞相比減少的程度較低。綜合以上結(jié)果,本研究工作說明PCV2感染PK-15細(xì)胞后,通過上調(diào)p53和p21的蛋白表達(dá),顯著降低CDK2和Cyclin A的表達(dá),顯著提高Cyclin E的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞周期由G1/S監(jiān)測點(diǎn)向S期過渡,并阻滯細(xì)胞通過G2/M監(jiān)測點(diǎn),進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在S期,為病毒自身的復(fù)制提供有利條件,而p53基因敲除可通過抑制PCV2誘導(dǎo)的p21表達(dá)、Cyclin A、CDK2減少和Cyclin E增加,進(jìn)而阻止S期細(xì)胞增多,抑制病毒自身的復(fù)制。
【關(guān)鍵詞】：豬圓環(huán)病毒2型 p53基因敲除 病毒感染 細(xì)胞周期阻滯
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-14
• 文獻(xiàn)綜述14-21
• 第一章 動物病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯研究進(jìn)展14-21
• 1.1 細(xì)胞周期概述14-15
• 1.1.1 細(xì)胞間期14
• 1.1.2 細(xì)胞分裂期14-15
• 1.2 細(xì)胞周期調(diào)控15-16
• 1.2.1 細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)15
• 1.2.2 細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDKs)15-16
• 1.2.3 細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子(CKI)16
• 1.2.4 細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)16
• 1.3 病毒感染與細(xì)胞周期16-17
• 1.3.1 病毒感染對細(xì)胞周期的影響及相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制16-17
• 1.3.2 細(xì)胞周期的變化對病毒復(fù)制的影響17
• 1.4 p53在細(xì)胞周期和病毒感染中的調(diào)控作用17-19
• 1.4.1 p53分子簡介17-18
• 1.4.2 p53在細(xì)胞周期中的調(diào)控作用18
• 1.4.3 p53在病毒感染中的調(diào)控作用18-19
• 1.5 PCV2感染對細(xì)胞周期的影響19
• 1.5.1 PCV2病毒簡介19
• 1.5.2 PCV2感染對細(xì)胞周期的影響19
• 1.6 本研究的目的與意義19-21
• 試驗(yàn)研究21-44
• 第二章 p53基因敲除細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定21-32
• 2.1 試劑材料21-22
• 2.1.1 主要試劑21
• 2.1.2 主要儀器21
• 2.1.3 主要試劑的配制21-22
• 2.2 方法22-28
• 2.2.1 重組目的質(zhì)粒的構(gòu)建22-24
• 2.2.2 慢病毒包裝24
• 2.2.3 慢病毒滴度測定24-26
• 2.2.4 確定嘌呤霉素篩選的最適濃度26
• 2.2.5 篩選穩(wěn)定感染的陽性細(xì)胞26
• 2.2.6 Western Blotting檢測26-27
• 2.2.7 細(xì)胞基因組測序法鑒定27-28
• 2.3 結(jié)果與分析28-30
• 2.3.1 p53基因敲除位點(diǎn)的確定28
• 2.3.2 雙酶切鑒定28-29
• 2.3.3 Western blotting檢測構(gòu)建細(xì)胞的p53基因敲除情況29
• 2.3.4 細(xì)胞基因組測序29-30
• 2.4 討論30-31
• 2.5 小結(jié)31-32
• 第三章 PCV2感染對細(xì)胞周期的影響32-39
• 3.1 試劑材料32
• 3.1.1 主要試劑32
• 3.1.2 主要儀器32
• 3.1.3 試驗(yàn)溶液的配制32
• 3.2 方法32-33
• 3.2.1 細(xì)胞同步化處理32-33
• 3.2.2 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期33
• 3.2.3 病毒的絕對定量33
• 3.2.4 Western blotting檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)33
• 3.3 結(jié)果與分析33-37
• 3.3.1 PCV2感染對非同步化PK-15細(xì)胞周期的影響33-34
• 3.3.2 PCV2感染對同步化PK-15細(xì)胞周期的影響34-35
• 3.3.3 病毒的絕對定量35-36
• 3.3.4 PCV2感染對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響36-37
• 3.3.5 細(xì)胞各時期PCV2-Cap蛋白的表達(dá)情況37
• 3.4 討論37-38
• 3.5 小結(jié)38-39
• 第四章 p53在PCV2誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和其自身復(fù)制中的作用39-44
• 4.1 試劑材料39
• 4.1.1 主要試劑39
• 4.1.2 主要儀器39
• 4.1.3 主要試劑的配制39
• 4.2 方法39
• 4.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期39
• 4.2.2 病毒的絕對定量39
• 4.2.3 Western blotting檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白39
• 4.3 結(jié)果與分析39-42
• 4.3.1 p53基因敲除抑制PCV2誘導(dǎo)的S期細(xì)胞阻滯39-41
• 4.3.2 p53基因敲除抑制PCV2在PK-15細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制41
• 4.3.3 p53敲除對PCV2感染細(xì)胞周期蛋白的影響41-42
• 4.3.4 p53基因敲除抑制PCV2-Cap蛋白的表達(dá)42
• 4.4 討論42-43
• 4.5 小結(jié)43-44
• 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 主要縮略詞和中英文對照表（Abbreviation Index）49-51
• 致謝51-52
• 作者簡介52

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本文編號：563209