本文關(guān)鍵詞：牛支原體pdhα和pdhβ基因的克隆、原核表達(dá)及亞細(xì)胞的定位

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【摘要】：牛支原體(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos taurus)的一種重要致病性支原體,感染后可引起牛多種疾病。丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1(pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1)是參與生物體糖代謝過程的一個限速酶,廣泛存在于微生物、哺乳動物及高等植物中,其直接影響丙酮酸向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。本研究參照Gen Bank中M.b PG45株的PDHc E1α亞基基因pdhα和PDHc E1β亞基基因pdhβ序列設(shè)計引物,通過PCR擴(kuò)增獲得M.b武威株的pdhα(Gen Bank登錄號:KU355295)及pdhβ基因(Gen Bank登錄號:KU355296),在序列測定的基礎(chǔ)上應(yīng)用重疊延伸PCR(Overlap PCR)技術(shù)完成基因優(yōu)化并構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒p ET-pdhα和p ET-pdhβ。表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)后經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)重組PDHc E1α亞基融合蛋白PDHA及PDHc E1β亞基蛋白PDHB。純化表達(dá)產(chǎn)物并分別免疫新西蘭兔(Oryctolagus cuniculus)制備多克隆抗體,進(jìn)而應(yīng)用Western blot及酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)對M.b PDHc E1α亞基和PDHc E1β亞基在細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明,經(jīng)IPTG的誘導(dǎo),pdhα與pdhβ基因在大腸桿菌BL21(DE3)中均成功表達(dá),重組蛋白r PDHA及r PDHB的分子量分別約為40和37 k D,且均有良好的免疫原性,而Western blot及ELISA結(jié)果證實E1α和E1β在牛支原體細(xì)胞膜上和胞漿中均有分布且分布量相當(dāng)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究M.b生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)資料。
【作者單位】： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院;
【關(guān)鍵詞】： 牛支原體(M.b) 丙酮酸脫氫酶 原核表達(dá) 膜定位
【基金】：甘肅省自然科學(xué)基金項目(No.1308RJZA235) 甘肅省高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費項目
【分類號】：S852.62
【正文快照】： 牛支原體(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos tau-rus)的一種重要致病性支原體,其感染可引起牛的肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、耳炎和角膜炎等多種疾病。自1962年首次分離并證實其致病性以來(Hale etal.,1962),M.b感染迅速向世界各地擴(kuò)散和蔓延。我國部分地區(qū)流行的犢牛傳染性壞死性肺

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本文編號：535834