本文關(guān)鍵詞：家蠅AS61、AS566和DefensinⅠ基因的表達及產(chǎn)物抑菌活性分析

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【摘要】：近年來,抗生素在臨床診治上的不合理使用導(dǎo)致細菌的耐藥性問題越發(fā)嚴(yán)峻,嚴(yán)重影響了人類以及動物的健康,因此,研發(fā)不易使致病菌產(chǎn)生耐藥性并且可代替抗生素的新型藥劑是目前急需解決的問題。家蠅(Musca domestica)通常生活在陰暗潮濕、雜菌叢生的環(huán)境中,但因其具有獨特的防御體系而極少受到病原菌侵染。家蠅抗菌蛋白及抗菌肽作為家蠅防御體系中的重要成分,對多種病原菌均具有抗菌活性,且因其具有不易產(chǎn)生耐藥性和對人畜均無毒副作用等優(yōu)點,已受到了國內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注。本研究以雞源致病性大腸桿菌以及雞源沙門氏菌誘導(dǎo)家蠅三日齡幼蟲構(gòu)建抑制性消減文庫中所篩選到的差異基因為基礎(chǔ),以5'-RACE-Ready cDNA為模板,利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)對一個未知功能基因AS61進行全長擴增,對其核酸序列及蛋白質(zhì)序列進行生物信息學(xué)分析,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-32a-AS61,進行原核表達并對其表達產(chǎn)物進行體外抑菌活性檢測。以課題組成功擴增出的家蠅抗菌蛋白AS566、家蠅防御素基因DefensinⅠ為基礎(chǔ),成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGAPZαA-AS566和pGAPZαA-DefensinⅠ,并進行真核表達,對其表達產(chǎn)物分別進行體外抑菌活性檢測。主要實驗結(jié)果如下:1、成功擴增出AS61基因全長序列,其ORF序列長度為537 bp。AS61生物信息學(xué)分析結(jié)果:AS61基因編碼179個氨基酸,其理論等電點為7.61,呈疏水性,不存在跨膜區(qū),含信號肽,二級結(jié)構(gòu)含有α 螺旋、不規(guī)則盤繞和延伸鏈,存在少量β 折疊。2、成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-32a-AS61并在大腸桿菌中獲得表達,誘導(dǎo)表達條件:IPTG濃度為0.4 mM,誘導(dǎo)時間為4 h。AS61表達產(chǎn)物為融合蛋白,大量存在于裂解液上清中。成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGAPZαA-AS566、pGAPZαA-DefensinⅠ并在畢赤酵母中分泌表達,表達產(chǎn)物分泌于上清液中,最佳表達時間為72 h。3、原核表達產(chǎn)物純化及濃縮后經(jīng)體外抑菌實驗檢測,AS61對大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌均無明顯抑制作用。真核表達產(chǎn)物濃縮后經(jīng)體外抗菌實驗表明,AS566對雞源沙門氏菌及豬源金黃色葡萄球菌均具有明顯抑制作用,對雞致病性大腸桿菌無明顯抑制作用;DefensinⅠ對大腸桿菌具有較弱的抑制作用,對沙門氏菌及金黃色葡萄球菌均無明顯抑制作用。以上實驗結(jié)果為進一步研究這三種家蠅幼蟲基因的作用機制奠定了基礎(chǔ),并為新型抗菌藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：抗菌肽 融合蛋白 分泌表達 抑菌活性
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S859.79
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 前言7-8
• 第一篇 文獻綜述8-14
• 第一章 家蠅抗菌肽的研究進展8-14
• 1.1 家蠅抗菌肽的分類及結(jié)構(gòu)特征8-9
• 1.2 家蠅抗菌肽的抗菌機制9-10
• 1.3 家蠅抗菌肽編碼基因的原核表達10-11
• 1.4 家蠅抗菌肽基因的真核表達11-12
• 1.5 家蠅抗菌肽的生物活性12
• 1.6 家蠅抗菌肽的應(yīng)用前景12-14
• 第二篇 研究內(nèi)容14-50
• 第一章 家蠅幼蟲差異基因的克隆及生物學(xué)分析14-29
• 1.1 實驗材料14-15
• 1.2 實驗方法15-21
• 1.3 結(jié)果與分析21-28
• 1.4 討論28
• 1.5 小結(jié)28-29
• 第二章 未知功能基因AS61的原核表達及抗菌蛋白AS566、防御素基因DefensinⅠ的真核表達29-43
• 2.1 實驗材料29-30
• 2.2 實驗方法30-36
• 2.3 實驗結(jié)果36-41
• 2.4 討論41-42
• 2.5 小結(jié)42-43
• 第三章 表達產(chǎn)物的純化、濃縮及抑菌活性的鑒定43-50
• 3.1 實驗材料43-44
• 3.2 實驗方法44-45
• 3.3 實驗結(jié)果45-47
• 3.4 討論47-48
• 3.5 小結(jié)48-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻51-55
• 作者簡介55-56
• 致謝56

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1 閆恕;家蠅AS61、AS566和DefensinⅠ基因的表達及產(chǎn)物抑菌活性分析[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

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本文編號：533889