本文關鍵詞：類彈性蛋白多肽融合犬干擾素的表達、純化和活性檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：干擾素(interferon, IFN)是一類具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)的作用的細胞因子,其中犬重組α干擾素已廣泛應用于犬病毒性疾病的治療,并獲得良好的治療效果。但現(xiàn)有的重組α干擾素多以組氨酸標簽融合蛋白在大腸桿菌中以包涵體表達并經過變性、復性和層析純化的方式制備。此方法制備的重組α干擾素不僅價格高,且體內半衰期短。延長干擾素體內半衰期的常見方式有聚乙二醇化和與血清白蛋白等蛋白標簽進行融合表達,前者反應條件和產品質量控制困難,后者仍然需要使用親和層析等成本較高的方法純化。類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)是一類由五個氨基酸組成的聚合物,具有溫度敏感的可逆相變特性,可用離心等簡單方法分離純化,已被用作重組蛋白的純化標簽。另外,由于良好的生物相容性,ELP還被用作體內藥物載體,以起緩釋和延長半衰期的作用。犬IL-29(CaIL-29)抗病毒作用有別于CaIFN-α,目前尚無基因工程產品上市。犬γ干擾素(CaIFN-γ)除具有抗病毒作用,還有免疫調節(jié)作用。本研究用PCR擴增CaIL-29和CaIFNα1成熟肽編碼序列,將其分別插入ELP融合表達載體pET-ELP,獲得重組表達載體pCaIL29-ELP和pELP-CaIFNα。再將合成的CaIFN-γ成熟肽序列插入pELP-CaIFNα中,獲得CaIFN-α與CaIFN-γ融合表達載體pELP-CaIFNαγ。分別將重組載體轉化BLR(DE3)和BL21(DE3)大腸桿菌,在37℃用IPTG誘導融合蛋白表達。SDS-PAGE分析結果顯示：pCaIL29-ELP、pELP-CaIFNα和pELP-CaIFNaγ重組菌均表達預期大小的融合蛋白,其中CaIL29-ELP融合蛋白為不溶性包涵體,ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ為可溶性表達。然后在優(yōu)化條件下進行CaIL29-ELP融合蛋白誘導表達,SDS-PAGE分析結果顯示在低于26℃條件下為可溶性表達。在此基礎上對IPTG誘導濃度和時間進行了優(yōu)化,CaIL29-ELP、 pELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ的最佳誘導表達條件為0.2mM IPTG、24℃和24h。分別在優(yōu)化條件下進行CaIL29-ELP、ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ誘導表達,對純化融合蛋白的相變溫度、鹽濃度等相變循環(huán)(ITC)參數(shù)進行了優(yōu)化,結果顯示CaIL29-ELP、 ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ的相變溫度分別為26℃、26℃和39℃,最佳氯化鈉濃度分別為3mol/L、3mol/L和3mol/L。純化融合蛋白用6mol/L尿素溶解,透析后進行SDS-PAGE分析,結果顯示CaIL29-ELP融合蛋白的純度為74%,濃度為0.08mg/mL; ELP-CaIFNα融合蛋白的純度為79%,濃度為0.14mg/mL; ELP-CaIFNαγ融合蛋白的純度為82%,濃度為0.13mg/mL以MDCK/VSV系統(tǒng)進行干擾素活性檢測,結果顯示CaIL29-ELP的抗病毒活性為2.5×104U/mg, ELP-CaIFNα的抗病毒效價為1.4×105U/mg, ELP-CaIFNαγ抗病毒效價為8.4×1 03U/mg。這些研究結果表明,本研究獲得的CaIL29-ELP、ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ融合干擾素具有較高的純度和較強的抗病毒活性,并可能有較長的體內半衰期,有望用于犬病毒病的治療。
【關鍵詞】：犬干擾素 類彈性蛋白多肽 融合表達 分離純化 抗病毒活性
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;S858.292
【目錄】：

• 摘要2-4
• ABSTRACT4-6
• 符號說明6-10
• 綜述一：犬干擾素的研究進展10-14
• 1. 干擾素的研究進展10-14
• 1.1 干擾素的分類10
• 1.2 干擾素的生物學特性及應用10-12
• 1.3 基因工程干擾素研究進展12
• 1.4 犬干擾素的研究進展12-14
• 綜述二：重組蛋白標簽的研究進展14-17
• 1. 融合標簽14-16
• 2. ELP標簽的應用16-17
• 研究內容一：類彈性蛋白多肽融合犬白介素29的表達與活性檢測17-34
• 1. 材料17-19
• 1.1 生物材料和主要試劑17-18
• 1.2 主要儀器設備18
• 1.3 培養(yǎng)基和常用溶液18-19
• 2 實驗方法19-28
• 2.1 基因克隆19-22
• 2.2 表達載體構建22-23
• 2.3 重組蛋白的誘導表達23-24
• 2.4 重組蛋白表達條件優(yōu)化24-26
• 2.5 融合干擾素活性檢測26-28
• 3 結果28-33
• 3.1 基因擴增28-29
• 3.2 pCaIL29-ELP構建29
• 3.3 融合蛋白表達29-31
• 3.4 相變循環(huán)參數(shù)優(yōu)化31-32
• 3.5 融合蛋白純化32
• 3.6 融合蛋白的活性測定32-33
• 4 討論33-34
• 研究內容二：類彈性蛋白多肽融合犬α干擾素的表達與活性檢測34-43
• 1 材料34-35
• 1.1 菌株、細胞、病毒34
• 1.2 主要工具酶與試劑34
• 1.3 培養(yǎng)基和常用溶液34
• 1.4 主要儀器34-35
• 2 實驗方法35-39
• 2.1 基因克隆35-36
• 2.2 表達載體構建36-38
• 2.3 重組蛋白誘導表達38
• 2.4 表達產物分析38
• 2.5 表達條件優(yōu)化38
• 2.6 融合蛋白純化38
• 2.7 干擾素活性測定38-39
• 3 結果39-42
• 3.1 融合表達載體構建39
• 3.2 融合蛋白表達分析39-40
• 3.3 融合蛋白表達條件優(yōu)化40-41
• 3.4 沉淀ELP-CaIFN α 1的鹽濃度41
• 3.5 ELP-CaIFN α 1融合蛋白的純化41-42
• 3.6 干擾素的活性測定42
• 4 討論42-43
• 研究內容三：ELP-CaIFN α-CaIFN γ的融合表達與抗病毒活性檢測43-50
• 1 材料43-44
• 1.1 生物材料43
• 1.2 工具酶與試劑43
• 1.3 培養(yǎng)基和常用溶液43
• 1.4 主要儀器43-44
• 2 實驗方法44-47
• 2.1 表達載體構建44-46
• 2.2 重組蛋白誘導表達46
• 2.3 誘導表達條件優(yōu)化46
• 2.4 表達條件優(yōu)化46
• 2.5 融合蛋白純化46
• 2.6 干擾素活性測定46-47
• 3 結果47-49
• 3.1 表達載體構建47
• 3.2 融合蛋白表達分析47-48
• 3.3 相變循環(huán)鹽濃度優(yōu)化48
• 3.4 融合蛋白純化48-49
• 3.5 融合干擾素的活性測定49
• 4 討論與總結49-50
• 全文總結50-51
• 參考文獻51-56
• 致謝56-57

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王璋瑜;;蛋白設計實驗室公司買下融合蛋白技術實用權[J];生物技術通報;1990年10期

2 張毅,屈賢銘,楊勝利;融合蛋白基因工程應用及研究[J];生物工程進展;2000年03期

3 楊林,李國清,黃葆英,王全忠,龍綮新,王s閼，

本文編號：458444