本文關(guān)鍵詞：雞NK細(xì)胞C-型凝集素樣受體蛋白BNK19的單抗制備，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自然殺傷(Natural killer,NK)細(xì)胞是哺乳動(dòng)物以及其他脊椎動(dòng)物天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,具有抗腫瘤、抗病毒感染的作用。NK細(xì)胞發(fā)揮殺傷功能與活化性受體與抑制性受體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞有關(guān)。近年來(lái),雞NK細(xì)胞的研究也逐漸受到重視,研究的主要困難在于缺乏確定的NK細(xì)胞表面標(biāo)志。b-nk基因編碼的BNK蛋白是表達(dá)于雞NK細(xì)胞表面的C型凝集素樣受體蛋白。BNK是高度糖基化的Ⅱ型跨膜蛋白,胞質(zhì)尾區(qū)有一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序,與哺乳動(dòng)物NK細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)相似,因此推測(cè)BNK蛋白是雞NK細(xì)胞的潛在受體。b-nk基因位于雞的主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex,MHC)核心區(qū)域,與MHC-B核心基因緊密連鎖。本研究利用國(guó)家禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心保存的MHC單倍型雞BW/G1等6個(gè)品系,包括B19、B21等MHC-B單倍型,根據(jù)NCBI上公布的不同單倍型雞的b-nk基因序列,比較了單倍型雞的b-nk基因多態(tài)性,生物信息學(xué)分析結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)單倍型序列完全一致,表明可以利用b-nk基因進(jìn)行MHC單倍型雞遺傳穩(wěn)定性監(jiān)測(cè),同時(shí)也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)材料。以對(duì)多種疫病有較強(qiáng)敏感性的B19單倍型雞b-nk基因原核表達(dá)蛋白(BNK19)免疫小鼠,建立間接ELISA方法,篩選獲得一株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株7A10,與原核表達(dá)的BNK21沒有Western Blot反應(yīng)性,具有鑒別意義。截短表達(dá)分析結(jié)果表明,7A10針對(duì)表位在E149-S168之間。從B19單倍型雞外周血中分離淋巴細(xì)胞,刀豆素-A刺激后,提取細(xì)胞總RNA,RT-PCR方法擴(kuò)增b-nk19基因,插入真核表達(dá)載體pIRES,成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES-BNK19,轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系,用G418加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)BNK19的細(xì)胞系。7A10單抗能夠通過Western Blot檢測(cè)到雞外周血淋巴細(xì)胞中BNK蛋白的表達(dá)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè),7A10標(biāo)記細(xì)胞占雞外周血淋巴細(xì)胞的16.7%。本實(shí)驗(yàn)為BNK蛋白在雞NK細(xì)胞中的分子機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：BNK蛋白 自然殺傷細(xì)胞 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S831
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文縮略表11-12
• 第一章 引言12-19
• 1.1 研究的目的和意義12-15
• 1.1.1 NK細(xì)胞的功能12-13
• 1.1.2 NK細(xì)胞受體的位置及分類13-14
• 1.1.3 NK細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)與功能14-15
• 1.2 雞NK細(xì)胞15-19
• 1.2.1 雞NK細(xì)胞的鑒定15-16
• 1.2.2 雞NK細(xì)胞受體基因16-17
• 1.2.3 雞NK細(xì)胞受體17-19
• 第二章 MHC單倍型BW/Gn雞群的b-nk基因序列分析19-23
• 2.1 材料19
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.1.3 主要儀器19
• 2.2 方法19-20
• 2.2.1 b-nk基因序列分析19
• 2.2.2 序列分析19-20
• 2.3 結(jié)果20-21
• 2.3.1 b-nk基因測(cè)序結(jié)果20
• 2.3.2 b-nk氨基酸序列分析20-21
• 2.4 討論21-23
• 第三章 B19單倍型雞BNK單克隆抗體的制備23-30
• 3.1 材料23
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23
• 3.1.2 主要試劑23
• 3.1.3 主要儀器23
• 3.2 方法23-27
• 3.2.1 BNK19蛋白的純化23-24
• 3.2.2 動(dòng)物免疫24
• 3.2.3 間接ELISA方法的建立24
• 3.2.4 細(xì)胞融合24-25
• 3.2.5 間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞25
• 3.2.6 雜交瘤細(xì)胞的亞克隆、凍存和復(fù)蘇25-26
• 3.2.7 雜交瘤細(xì)胞腹水的制備及純化26
• 3.2.8 單克隆抗體的亞型鑒定及腹水效價(jià)26
• 3.2.9 單克隆抗體腹水的Western Blot檢測(cè)26
• 3.2.10 單抗表位的鑒定26-27
• 3.3 結(jié)果27-29
• 3.3.1 BNK19原核表達(dá)蛋白純化結(jié)果27-28
• 3.3.2 間接ELISA方法的建立28
• 3.3.3 單抗亞型鑒定及腹水效價(jià)測(cè)定28
• 3.3.4 腹水的Western blot檢測(cè)28
• 3.3.5 7A10單抗表位的初步鑒定28-29
• 3.4 討論29-30
• 第四章 穩(wěn)定表達(dá)B19單倍型雞BNK蛋白的細(xì)胞系構(gòu)建30-36
• 4.1 材料30
• 4.1.1 生物材料30
• 4.1.2 主要試劑30
• 4.1.3 主要儀器30
• 4.2 方法30-32
• 4.2.1 b-nk19基因的引物設(shè)計(jì)30
• 4.2.2 b-nk19基因mRNA的提取及擴(kuò)增30-31
• 4.2.3 pIRES-BNK19真核表達(dá)載體的構(gòu)建31
• 4.2.4 pIRES-BNK19真核表達(dá)細(xì)胞系的建立31-32
• 4.2.5 BNK19蛋白表達(dá)細(xì)胞系的RT-PCR鑒定32
• 4.2.6 BNK19蛋白表達(dá)細(xì)胞系的IFA鑒定32
• 4.2.7 BNK19蛋白表達(dá)細(xì)胞系的Western Bolt鑒定32
• 4.2.8 CHO-BNK19穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立32
• 4.3 結(jié)果32-35
• 4.3.1 pIRES-BNK19重組質(zhì)粒的構(gòu)建32-33
• 4.3.2 表達(dá)BNK19蛋白瞬時(shí)細(xì)胞系的建立33
• 4.3.3 細(xì)胞系的RT-PCR鑒定33-34
• 4.3.4 IFA鑒定34
• 4.3.5 Western Bolt鑒定34-35
• 4.3.6 CHO-BNK19穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立35
• 4.4 討論35-36
• 第五章 雞不同組織淋巴細(xì)胞中BNK蛋白的表達(dá)36-40
• 5.1 材料36
• 5.1.1 生物材料36
• 5.1.2 主要試劑36
• 5.1.3 主要儀器36
• 5.2 方法36-37
• 5.2.1 BNK蛋白在雞胚脾臟淋巴細(xì)胞的表達(dá)36-37
• 5.2.2 BNK蛋白在外周血淋巴細(xì)胞的表達(dá)37
• 5.3 結(jié)果37-38
• 5.3.1 BNK蛋白在雞胚脾臟淋巴細(xì)胞中表達(dá)37-38
• 5.3.2 BNK蛋白在外周血淋巴細(xì)胞中表達(dá)38
• 5.4 討論38-40
• 第六章 全文結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-48
• 致謝48-49
• 作者簡(jiǎn)歷49

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 周蕾;謝建輝;顧建新;;CLEC-2剪切脫落的機(jī)制和功能研究[A];2008年全國(guó)糖生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2008年

2 洪誼;楊俊武;謝建輝;顧建新;;磷酸化抑制C型凝集素受體CLEC-2的泛素化及降解[A];2008年全國(guó)糖生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2008年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 謝建輝;C型凝集素樣受體Dectin-1與CLEC-2的相關(guān)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 吳少蓮;雞NK細(xì)胞C-型凝集素樣受體蛋白BNK19的單抗制備[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

  本文關(guān)鍵詞：雞NK細(xì)胞C-型凝集素樣受體蛋白BNK19的單抗制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：441607