本文關鍵詞：江蘇某豬場2015-2016年豬流行性腹瀉病毒分子流行病學調查及基于S蛋白的抗體間接ELISA檢測方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病,是目前世界范圍內豬場多發(fā)的豬病之一。自2010年10月以來,豬流行性腹瀉病的流行強度和流行區(qū)域在不斷地加強和擴大,尤其對哺乳仔豬致死率較高,可高達100%。在很多接種過PED疫苗的豬場,本病發(fā)病率及仔豬死亡率仍居高不下,并出現(xiàn)與其他病原混合感染的現(xiàn)象,大大增強了該病的防控難度,也給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此,對PED的診斷及其抗體監(jiān)測具有重要意義。雖然目前,已有多種PED的診斷和抗體監(jiān)測技術,如全病毒包被的ELISA、間接免疫熒光試驗(IFA)等。但全病毒包被ELISA存在大量制備抗原困難、有散毒危險等缺點。IFA則需要昂貴的特殊設備,不適用于臨床檢測。利用蛋白表達分子生物學技術建立間接ELISA方法成為檢測PEDV抗體新的方向。本研究從江蘇某豬場進行間斷性采樣方法以對豬流行性腹瀉病毒進行分子流行病學調查,利用表達純化的S蛋白建立了檢測其抗體的間接ELISA檢測方法,可進一步了解江蘇某豬場PED的流行特點,評價豬群感染或免疫抗體,為豬群PED疫苗選擇及免疫疫苗后的抗體檢測提供理論指導及檢測手段。1.江蘇某豬場PEDV分子流行病學調查為了解江蘇某豬場PEDV的流行情況,應用RT-PCR方法對2015年3月至2016年3月間從江蘇某豬場采集的106份疑似豬流行性腹瀉樣品進行PEDV檢測,檢測結果顯示PEDV陽性率為30.19%(32/106),豬場內各年齡段的豬均有出現(xiàn)PEDV感染的現(xiàn)象。設計了針對M、N和ORF3基因的特異性引物,對其中2個陽性樣品進行全長擴增,并將擴增的產(chǎn)物進行測序。測序結果與國內外相應的基因序列進行比對并構建遺傳進化樹,發(fā)現(xiàn)目前分離PEDV參考株主要分為G1、G2兩大支,而該豬場的流行毒株位于G1支上,基于ORF3基因的遺傳進化樹分析可推測,豬場流行毒為PEDV野毒,與國內流行毒相近。2. PEDV部分S基因的原核表達PEDV的S蛋白在免疫介導中起著重要作用,因此本研究對豬場流行毒株的部分S基因(編碼蛋白可產(chǎn)生中和抗體,標記為Sp)進行擴增,長度為711 bp,進一步克隆至pET-32a,構建了pET-Sp原核表達質粒。重組表達質粒轉化BL21感受態(tài)細胞后,在28℃、200 rpm條件下,經(jīng)0.2 mM濃度的IPTG誘導獲得可溶性重組S蛋白。Western-blot試驗證明表達的重組蛋白可與PEDV陽性血清發(fā)生特異性反應,說明該重組蛋白有較好的抗原性。3. PEDV抗體間接ELISA檢測方法的初步建立為監(jiān)測豬場豬群PEDV抗體水平,初步建立了檢測PEDV抗體的間接ELISA方法。純化的S蛋白作為包被抗原,最優(yōu)的包被濃度為0.5 μg/ml,4℃包被過夜,10%的小牛血清37℃封閉2 h,最優(yōu)的待檢血清稀釋度為1：200,37℃作用1 h, HRP標記的兔抗豬IgG 1：8000稀釋,37℃作用1 h,加入TMB顯色液10 min后終止反應。當待檢血清OD450≥0.273時判為陽性,待檢血清OD4500.273時判為陰性。用建立的間接ELISA方法對商品化試劑盒中PRRSV、CSFV、PRV、PCV、FMDV等常見豬病的抗體陽性對照進行檢測均呈陰性,說明該方法具有良好的特異性。分別用不同批次純化的蛋白及同一批次純化蛋白包被的酶標板對血清樣品進行檢測,結果表明該方法具有較好的重復性。用建立的間接ELISA方法對臨床47份豬血清進行檢測,陽性率為72.34%,與進口某公司PEDV抗體ELISA檢測試劑盒結果進行比較,其符合率為95.74%。說明該方法適用于臨床豬群PEDV抗體水平檢測,同時也為以后診斷試劑盒的研制奠定基礎。
【關鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 分子流行病學調查 S蛋白 原核表達 間接ELISA檢測
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 符號說明8-9
• 文獻綜述9-22
• 參考文獻18-22
• 第一章 江蘇某豬場PEDV分子流行病學調查22-36
• 1 材料22-23
• 2 方法23-28
• 3 結果28-33
• 4 討論33-35
• 參考文獻35-36
• 第二章 豬流行性腹瀉病毒部分S基因的原核表達36-53
• 1 材料36-38
• 2 方法38-44
• 3 結果44-50
• 4 討論50-52
• 參考文獻52-53
• 第三章 PEDV抗體間接ELISA檢測方法的建立53-67
• 1 材料53-55
• 2 方法55-58
• 3 結果58-64
• 4 討論64-66
• 參考文獻66-67
• 全文小結67-68
• 致謝68-69

【參考文獻】

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本文編號：431485