豬輪狀病毒(Porcine rotavirus,PRV)是無囊膜、分節(jié)段的雙股RNA病毒,隸屬于呼腸孤病毒科,是引起幼年仔豬發(fā)生腹瀉的主要病原之一。豬輪狀病毒感染世界各地分布廣泛,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損火,故研究一種有效地抑制病毒感染的方法尤為重要。VP4蛋白是輪狀病毒粒子中最重要的結(jié)構蛋白之一,是一種中和抗原,能夠刺激動物機體產(chǎn)生抗病毒中和抗體,激發(fā)免疫保護,在PRV的診斷及預防中具有非常重要的作用。 本實驗根據(jù)GenBank所收錄的PRV JL94株VP4基因堿基序列,設計一對特異性引物,從本實驗室分離鑒定的DN30209株擴增VP4全長基因,并成功構建重組質(zhì)粒VP4-pMD18-To重組質(zhì)粒經(jīng)測序和分析表明：DN30209株VP4全基因長2331bp,包含完整的開放閱讀框,與參考株JL94的核苷酸同源性為99.7%,氨基酸同源性為99.5%。將VP4全長基因連接到pGEX-6P-1原核表達載體中,構建并篩選出陽性原核表達載體重組質(zhì)粒,標記為pGEX-6P-1-VP4。將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta宿主菌感受態(tài)細胞中,經(jīng)IPTG誘導,獲得以包涵體形式表達的重組蛋白,融合蛋白大...

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 豬輪狀病毒的研究進展
        1.1.1 豬輪狀病毒的歷史研究背景
        1.1.2 豬輪狀病毒的流行病學特點
        1.1.3 豬輪狀病毒病的診斷與防治措施
    1.2 豬輪狀病毒的生物學進展
        1.2.1 豬輪狀病毒的形態(tài)及理化性質(zhì)
        1.2.2 豬輪狀病毒的抗原及其分型
        1.2.3 豬輪狀病毒的細胞培養(yǎng)特性
    1.3 豬輪狀病毒蛋白及其功能研究
        1.3.1 豬輪狀病毒基因組的結(jié)構特征
        1.3.2 豬輪狀病毒結(jié)構蛋白及作用
        1.3.3 豬輪狀病毒非結(jié)構蛋白及其功能
    1.4 脂筏研究進展
        1.4.1 脂筏的概念及結(jié)構功能
        1.4.2 研究脂筏與病毒感染的常用方法
    1.5 細胞膜膽固醇在病毒感染中的作用
        1.5.1 在包膜病毒中的作用
        1.5.2 在無囊膜病毒中的作用
    1.6 研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 病毒與細胞
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 菌種及載體
        2.1.4 試劑盒、工具酶及抗體試劑
        2.1.5 主要藥品及試劑
        2.1.6 主要試劑配制及儲存
        2.1.7 儀器及設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 豬輪狀病VP4全長基因的克隆
        2.2.2 感受態(tài)的制備
        2.2.3 重組質(zhì)粒VP4-pMD18-T質(zhì)粒的構建
        2.2.4 原核表達載體質(zhì)粒pGEX-6P-1-VP4的構建
        2.2.5 重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-VP4的誘導表達
        2.2.6 重組蛋白的純化及復性
        2.2.7 豬輪狀病毒VP4多克隆抗體的制備與鑒定
        2.2.8 膽固醇對豬輪狀病毒感染的影響實驗
    2.3 統(tǒng)計分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 豬輪狀病毒原核表達載體的構建
        3.1.1 豬輪狀病毒VP4基因的克隆
        3.1.2 重組質(zhì)粒VP4-pMD18-T的構建及鑒定
        3.1.3 重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-VP4的構建及鑒定
    3.2 融合蛋白的表達與純化
        3.2.1 融合蛋白的表達
        3.2.2 豬輪狀病毒VP4蛋白的純化
    3.3 豬輪狀病毒VP4多克隆抗體的生物活性鑒定
        3.3.1 豬輪狀病毒VP4多克隆抗體效價的檢測
        3.3.2 豬輪狀病毒VP4多抗血清的間接免疫熒光檢測
        3.3.3 豬輪狀病毒VP4多抗血.清的Western Blot檢測
    3.4 膽固醇對豬輪狀病毒感染的影響實驗
        3.4.1 豬輪狀病毒DN30209毒株在MA104細胞上的病變
        3.4.2 膽固醇消耗對病毒感染的影響
        3.4.3 膽固醇恢復對病毒感染的影響
4 討論
    4.1 豬輪狀病毒VP4全基因的克隆與序列比較
    4.2 豬輪狀病毒VP4基因在大腸桿菌中的表達
        4.2.1 豬輪狀病毒VP4原核表達質(zhì)粒的設計與構建
        4.2.2 重組蛋白的純化與復性
    4.3 多克隆抗體血清的制備與鑒定
    4.4 細胞膜中膽固醇對豬輪狀病毒感染MA104細胞的影響
        4.4.1 消耗細胞膜膽固醇對豬輪狀病毒感染的影響
        4.4.2 補充細胞膜膽固醇可使豬輪狀病毒的感染力得到恢復
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文



本文編號：4031313