為探究miR-18b對兔卵巢顆粒細胞增殖凋亡的作用及潛在調控靶點,利用生物信息學技術預測兔miRNA-18b(ocu-miR-18b)的靶基因及其可能參與的生物學過程。預測結果發(fā)現(xiàn)靶基因的功能注釋分析顯著富集在細胞增殖和凋亡的調控等過程,而其中CDK19可能是miR-18b的潛在靶基因。為驗證假設,將擴增的野生型及突變型的CDK19 3'UTR序列分別克隆至熒光素酶報告載體中,與miR-18b的mimics(試驗組)或mimics NC(對照組)共同轉染至HEK293T細胞。通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測細胞的熒光素酶活性,鑒定miR-18b與CDK19 3'UTR的靶向關系。并且通過qRT-PCR檢測miR-18b對靶基因的調控作用。結果表明:成功構建了CDK19基因3'UTR熒光素酶報告質粒,證明了miR-18b可以作用于CDK19基因3'UTR,抑制其熒光素酶活性。此外,qRT-PCR分析表明,miR-18b與CDK19表達模式相反。從而證明了miR-18b與CDK19的直接靶向關系,為更深入研究miR-18b與卵巢顆粒細胞的關系奠定基礎。

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【部分圖文】：

圖1 miR-18b靶基因預測的文氏圖

用miRWalk、ENCORI、miRanda分別預測到2398、2826、7306個miR-18b的靶基因,取三者的交集,獲得332個靶基因(圖1)。2.1.3靶基因預測GO分析

圖2 miR-18b預測靶基因的GO注釋

KEGG分析結果顯示,miR-18b的靶基因集合顯著富集于胞吞作用、調節(jié)干細胞多能性、癌癥中的MicroRNA、癌癥的途徑、胰腺癌、TGF-β、內質網中的蛋白質加工、膀胱癌和PI3K-Akt等信號通路(P<0.05)(圖3)。這些信號通路在細胞增殖和凋亡中發(fā)揮著重要的調控作用....

圖3 miR-18b預測的靶基因pathway富集分析

圖2miR-18b預測靶基因的GO注釋2.2miR-18b特異性結合CDK19

圖4 miR-18b直接靶向CDK19的3"UTR區(qū)

首先進行野生型(wt)和突變型(mt)載體的構建,然后將兩組質粒載體分別與miR-18b的mimics或mimicsNC共轉染至HEK293T細胞,檢測雙熒光素酶活性。結果顯示,wt+mimics組與wt+mimicsNC組的雙熒光素酶活性相比顯著降低,而mt組的活性無顯著....

本文編號：4015379