腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC)是一類(lèi)人獸共患病病原菌,感染后可以引起人和動(dòng)物的一系列臨床癥狀。其中典型的腸外感染包括尿道、生殖道感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)感染,并且感染數(shù)量逐年上升,增加了醫(yī)療成本,動(dòng)物生產(chǎn)力下降,給社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。細(xì)菌多重耐藥性和生物被膜的形成,以及缺乏有效保護(hù)的疫苗,均使ExPEC的防控更加困難。在許多革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜中,均發(fā)現(xiàn)有多藥抗性外排系統(tǒng)的存在,與臨床細(xì)菌多重耐藥性相關(guān)。多藥抗性外排泵(Multidrug-resistance efflux pumps)由三組分構(gòu)成：位于細(xì)胞膜內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、位于周質(zhì)間隙中的輔助蛋白、位于細(xì)胞膜外膜上的外膜蛋白,三者形成一個(gè)三聚體,由質(zhì)子泵勢(shì)能供能而發(fā)揮作用。耐大腸菌素TolC (Tolerant colicin)外膜蛋白是組成革蘭氏陰性菌多藥抗性外排泵的最重要的組成成分,參與許多不同家族外排泵的形成,介導(dǎo)多重耐藥性的產(chǎn)生。近年來(lái)有研究表明TolC蛋白參與細(xì)菌的毒力和生物被膜的形成,并可參與細(xì)菌自身代謝產(chǎn)...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞(ABBREVIATION)
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 腸外致病性大腸桿菌(EXPEC)病原學(xué)研究進(jìn)展
        1.1.1 大腸桿菌簡(jiǎn)介
        1.1.2 大腸桿菌的分群
        1.1.3 大腸桿菌分型
        1.1.4 ExPEC的毒力(相關(guān))因子
        1.1.5 ExPEC的致病機(jī)理
        1.1.6 ExPEC的感染臨床癥狀和病理變化
        1.1.7 ExPEC感染的流行病學(xué)分析
        1.1.8 ExPEC的診斷、預(yù)防和治療
    1.2 大腸桿菌生物被膜研究進(jìn)展
        1.2.1 細(xì)菌生物被膜概述
        1.2.2 生物被膜的危害
        1.2.3 大腸桿菌生物被膜形成相關(guān)因子的研究
        1.2.4 生物被膜細(xì)菌與懸浮細(xì)菌的生物學(xué)比較
        1.2.5 生物被膜的控制和消除
        1.2.6 展望或結(jié)語(yǔ)
    1.3 細(xì)菌多藥外排泵研究進(jìn)展
        1.3.1 前言
        1.3.2 多藥外排泵的組成
        1.3.3 多藥外排泵的調(diào)控研究進(jìn)展
        1.3.4 多藥外排泵AcrAB-TolC在細(xì)菌生理活動(dòng)中的作用
        1.3.5 多藥外排泵抑制劑研究進(jìn)展
        1.3.6 多重耐藥外排泵研究展望
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 TolC在ExPEC生物被膜形成中的功能研究
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 菌株與載體
        2.2.2 主要試劑、主要儀器和設(shè)備
        2.2.3 大腸桿菌χ7213感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.4 質(zhì)粒的小量制備
        2.2.5 tolC缺失突變株及其回復(fù)補(bǔ)償株的構(gòu)建
            2.2.5.1 細(xì)菌基因組DNA的制備
            2.2.5.2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成
            2.2.5.3 缺失突變株的構(gòu)建
            2.2.5.4 tolC回復(fù)補(bǔ)償株的構(gòu)建
        2.2.6 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        2.2.7 試驗(yàn)菌株對(duì)抗菌藥物最小抑菌濃度的測(cè)定(MIC測(cè)定)
        2.2.8 細(xì)菌生物被膜形成能力的測(cè)定
        2.2.9 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的測(cè)定
        2.2.10 生物被膜細(xì)菌在掃描電子顯微鏡下形態(tài)觀察
        2.2.11 細(xì)菌curli菌毛和纖維素生物合成能力的測(cè)定
        2.2.12 不同滲透壓對(duì)試驗(yàn)菌株生物被膜形成能力的影響
        2.2.13 不同培養(yǎng)基成分對(duì)試驗(yàn)菌株生物被膜形成能力的影響
        2.2.14 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)試驗(yàn)菌株基因的轉(zhuǎn)錄水平
            2.2.14.1 細(xì)菌RNA的提取
            2.2.14.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
            2.2.14.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.2.15 細(xì)菌外膜完整性的透射電鏡(TEM)觀察
        2.2.16 TRANS-WELL試驗(yàn)
        2.2.17 CpxR,OmpR,TolC缺失株的生物被膜形成能力比較
    2.3. 結(jié)果與分析
        2.3.1 缺失株和回補(bǔ)株的構(gòu)建
        2.3.2 MIC測(cè)定
        2.3.3 生長(zhǎng)曲線
        2.3.4 WT和ΔtolC菌株生物被膜形成能力比較
        2.3.5 M9培養(yǎng)基中curli菌毛和cellulose生物合成能力的比較
        2.3.6 電子掃描顯微鏡(SEM)下細(xì)菌表面形態(tài)的比較
        2.3.7 1/2M9培養(yǎng)基中生物被膜的形成能力、curli形成能力的比較
        2.3.8 在不同培養(yǎng)基成分中生物被膜形成能力的比較
        2.3.9 不同氯化鈉和蔗糖濃度對(duì)生物被膜形成的影響
        2.3.10 qRT-PCR檢測(cè)curli和cellulose合成相關(guān)基因的表達(dá)
        2.3.11 細(xì)菌外膜完整性的比較
        2.3.12 Trans-well
        2.3.13 CpxR及OmpR缺失株與TolC缺失株生物被膜形成能力的比較
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
第三章 TolC缺失對(duì)ExPEC致病性的影響
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 菌株、細(xì)胞和培養(yǎng)基
        3.2.2 主要儀器和設(shè)備
        3.2.3 主要試劑
        3.2.4 curli形成能力的比較
        3.2.5 細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌的準(zhǔn)備
        3.2.6 細(xì)菌的細(xì)胞粘附和侵襲試驗(yàn)
        3.2.7 細(xì)菌在巨噬細(xì)胞存活試驗(yàn)
        3.2.9 小鼠感染試驗(yàn)
        3.2.10 組織病理學(xué)觀察
        3.2.11 蛋白質(zhì)組學(xué)比較
            3.2.11.1 菌體的培養(yǎng)與及破碎
            3.2.11.2 膜蛋白的提取
            3.2.11.3 蛋白定量
            3.2.11.4 雙向電泳
            3.2.11.5 凝膠染色
            3.2.11.6 凝膠圖像掃描
            3.2.11.7 膠內(nèi)酶解及Ziptip脫鹽
            3.2.11.8 MaWi-TOF-TOF
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 curli菌毛形成能力的比較
        3.3.2 ΔtolC株對(duì)上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的粘附和侵襲能力下降
        3.3.3 ΔtolC株在巨噬細(xì)胞中的存活能力下降
        3.3.4 ΔtolC株在小鼠感染試驗(yàn)中毒力下降
        3.3.5 組織病理學(xué)損傷比較
        3.3.6 WT菌株與ΔtolC株的外膜蛋白質(zhì)組學(xué)比較
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
第四章 TolC缺失對(duì)ExPEC在高滲環(huán)境下存活能力的影響
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 菌株和培養(yǎng)
        4.2.2 TolC缺失對(duì)ExPEC在高濃度的NaCl和蔗糖下存活能力的影響
        4.2.3 外排泵抑制劑CCCP對(duì)ExPEC在高滲環(huán)境下存活能力的影響
        4.2.4 CCCP對(duì)ExPEC生物被膜形成的影響
        4.2.5 活菌計(jì)數(shù)
        4.2.6 統(tǒng)計(jì)分析
    4.3 結(jié)果
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
已發(fā)表文章
附錄：個(gè)人簡(jiǎn)歷
致謝



本文編號(hào)：3975849