【目的】本研究通過克隆禽源U6（cU6）和人源U6（hU6）啟動子，構(gòu)建以綠色熒光蛋白EGFP作為報告基因的真核表達載體，分別比較二者在Hela細胞和DF-1細胞中的轉(zhuǎn)錄活性，進一步分析cU6啟動子在禽源細胞體外表達系統(tǒng)中的應(yīng)用潛力；應(yīng)用cU6啟動子構(gòu)建真核表達載體，建立雞朊蛋白（ChPrPC）過表達的DF-1穩(wěn)定細胞系，為進一步探討ChPrPC影響禽類細胞分化、增殖及凋亡的分子機制提供穩(wěn)定的細胞模型；參考PrPC的促細胞增殖及粘附的功能，通過分析ChPrPC過表達對DF-1細胞增殖、粘附和侵襲的影響，為進一步闡明ChPrPC生理功能提供依據(jù)。 【方法】參考已報道的U6啟動子序列設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增和克隆獲得cU6和hU6核心啟動子序列，構(gòu)建以綠色熒光蛋白作為報告基因的禽源和人源U6啟動子重組表達載體，分別轉(zhuǎn)染Hela和DF-1細胞系，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡、熒光定量RT-PCR、Western blot、流式細胞術(shù)等方法，分別檢測不同的重組載體轉(zhuǎn)染Hela和DF-1細胞12、24和36h后熒光陽性細胞數(shù)和EGFP表達水平差異；根據(jù)本實驗室已克隆的雞朊蛋白基因全長序列設(shè)計引物，通...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖1-1核心啟動子元件示意圖

生物體所具有的遺傳性狀稱之為表型，表型是基因型與外界環(huán)境因素相互作用的。傳統(tǒng)研究認為，除環(huán)境因素影響外，生物體表型多態(tài)性主要是由于相關(guān)基因編碼區(qū)造成的。近年研究發(fā)現(xiàn)，兩個相近物種的蛋白質(zhì)組成基本相同，卻表現(xiàn)出明顯的生理異[1]。因此，越來越多學(xué)者認為，物種間的差異不僅是基因水平上....

圖1-2Caudal蛋白激活DPE元件或TATA框元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄Fig.1-2CaudalactivatestranscriptionfromDPE-dependentorTATA-dependentcorepromoters.

件（Motiftenelement，MTE）是過表達基因啟動子序列的功能性激活位于DPE元件上游，處于Inr下游+18至+27位點，該序列元件在NA中高度保守[27]。DNaseⅠ足跡法證實，MTE元件同DPE元件相FⅡD特異性識別的序列元件[28]。MT....

圖2-1人朊蛋白一級結(jié)構(gòu)示意圖

（Cys）殘基之間有一個二硫鍵，能夠穩(wěn)定朊蛋白的高級構(gòu)象（圖2-1）[13]。序列分析顯示，禽類PrP同哺乳動物朊蛋白基因推導(dǎo)氨基酸序列序列相比，同源性僅有30%。然而比較其高級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，二者C-端均由2個短的反向平行β折疊和3個α螺旋組成球型結(jié)構(gòu)域,且組成的二級結(jié)構(gòu)元件長度及....

圖2-2朊蛋白通過GPI錨定于細胞表面的高級結(jié)構(gòu)示意圖

同源性僅有30%。然而比較其高級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，二者C-端均由2個短的反向平行β折疊和3個α螺旋組成球型結(jié)構(gòu)域,且組成的二級結(jié)構(gòu)元件長度及位置基本相同，并通過GPI受體結(jié)合位點附著于細胞膜上（圖2-2）[14]。哺乳動物朊蛋白N-端的氨基酸殘基之間有一個富含組氨酸和甘氨酸的八肽重復(fù)....

本文編號：3969462