本研究首先利用同源重組一步克隆法將雞傳染性貧血病病毒(CIAV)的VP3基因克隆到pGEX-6P-1原核表達載體上,經(jīng)IPTG誘導及SDS-PAGE分析成功獲得了重組蛋白rGST-VP3的表達。隨即以純化的重組蛋白rGST-VP3免疫Balb/c小鼠,通過脾細胞與SP2/0細胞融合以及間接免疫熒光(IFA)篩選,獲得2株穩(wěn)定分泌CIAV-VP3抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8;亞型鑒定表明,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均為IgG1;效價測定發(fā)現(xiàn),CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8的腹水間接免疫熒光效價分別為1:102 400與1:12 800;Western blot進一步證實,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均能識別重組蛋白rGST-VP3。本研究結(jié)果為后期研究VP3蛋白在CIAV致病中作用及其誘導凋亡分子機制奠定了堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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【部分圖文】：

圖2誘導表達SDS-PAGE結(jié)果

圖1重組載體PCR鑒定2.3抗VP3蛋白特異性單克隆抗體篩選及特性

圖4純化的重組蛋白rGST-VP3的Westernblot結(jié)果

圖3純化后的重組蛋白rGST-VP3SDS-PAGE結(jié)果3討論

圖1重組載體PCR鑒定

將破碎后的重組菌上清和沉淀進行SDS-PAGE分析表明,在35kDa左右出現(xiàn)特異性條帶,而且目的條帶主要存在于細菌破碎后的上清液中(圖2)。Westernblot結(jié)果顯示,以病毒免疫小鼠血清做一抗,在35kDa左右出現(xiàn)一條條帶(圖3),與預期結(jié)果相符。將誘導表達后細菌進行超....

圖3純化后的重組蛋白rGST-VP3SDS-PAGE結(jié)果

以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VP3的DF-1細胞為抗原,通過IFA方法篩選出了2株與CIAV-VP3反應(yīng)的陽性雜交瘤細胞株,分別挑取一個單克隆細胞建株命名為CIAV-VP3-4G8和CIAV-VP3-4D7,具體IFA熒光結(jié)果如圖5所示。將2株陽性雜交瘤細胞連續(xù)3次亞克隆,所有單克隆....

本文編號：3967511