CD3分子是T淋巴細胞的重要表面標志,在抗原識別中,CD3分子起著信號傳遞的重要作用,許多疾病的研究中都以它作為檢測的重要指標。制備可用于分選和測定鵝體內(nèi)CD3+T細胞群的特異性單克隆抗體,有助于了解鵝細胞免疫的功能及狀態(tài),為深入研究鵝的細胞免疫機理奠定一定的物質(zhì)和理論基礎(chǔ)。 本研究首先根據(jù)GenBank中綠頭鴨CD3ε基因設(shè)計引物,利用RT-PCR方法首次克隆得到鵝CD3ε基因。并對克隆得到的序列進行了同源性分析、信號肽預(yù)測、糖基化位點的預(yù)測及不同物種間CD3ε鏈的進化樹分析,證實克隆得到的序列為鵝CD3ε基因。 其次根據(jù)克隆鵝CD3ε基因序列設(shè)計特異性表達引物,將獲得鵝CD3ε胞外區(qū)基因克隆入真核表達載體pcDNA3.1(+),并轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞(CEF),間接免疫熒光結(jié)果顯示,鵝CD3ε胞外區(qū)蛋白在真核細胞中獲得表達。同時將鵝CD3ε胞外區(qū)基因亞克隆至原核表達載體pET-28a(+)中,并在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中進行表達,獲得重組鵝CD3ε胞外區(qū)蛋白(rGoCD3s),利用鎳柱對目的蛋白進行純化,并以其為免疫原制備抗鵝CD3ε胞外區(qū)多克隆抗體。 最后本研究以重組質(zhì)粒pcDNA3...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 禽類T淋巴細胞表面主要CD分子概述
        1.1.1 CD3分子
        1.1.2 CD4分子
        1.1.3 CD8分子
    1.2 禽類CD3分子研究進展
        1.2.1 CD3基因結(jié)構(gòu)的研究
        1.2.2 CD3分子結(jié)構(gòu)的研究
        1.2.3 CD3分子功能的研究
        1.2.4 禽CD3+T細胞發(fā)育及分布
    1.3 各種CD分子的單克隆抗體的應(yīng)用
        1.3.1 CD單抗在理論研究中的應(yīng)用
        1.3.2 CD單抗在檢測技術(shù)中的應(yīng)用
    1.4 DNA免疫制備單克隆抗體的研究進展
        1.4.1 DNA免疫的機制
        1.4.2 DNA免疫的方法
        1.4.3 DNA免疫的優(yōu)點
        1.4.4 DNA免疫的應(yīng)用前景
    1.5 研究的目的及意義
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 細胞及菌株
        2.1.2 試驗動物
        2.1.3 試劑
        2.1.4 主要溶液配制
        2.1.5 細胞培養(yǎng)溶液
        2.1.6 主要儀器
    2.2 試驗方法
        2.2.1 鵝CD3ε基因的克隆與分析
        2.2.2 鵝CDε胞外區(qū)基因的克隆、原核表達及抗原性鑒定
        2.2.3 兔抗鵝CD3ε胞外區(qū)多克隆抗體的制備與鑒定
        2.2.4 鵝CD3ε胞外區(qū)單克隆抗體的制備
        2.2.5 鵝CD3ε胞外區(qū)單克隆抗體的鑒定
        2.2.6 鵝CD3ε胞外區(qū)單克隆抗體的初步應(yīng)用
3 結(jié)果
    3.1 鵝CD3ε基因的克隆及生物信息學(xué)分析
        3.1.1 鵝CD3ε基因的克隆
        3.1.2 鵝CD3ε基因的生物信息學(xué)分析
    3.2 鵝CD3ε胞外區(qū)基因的克隆、原核表達及抗原性鑒定
        3.2.1 鵝CD3ε胞外區(qū)基因的擴增與鑒定
        3.2.2 鵝CD3ω胞外區(qū)基因原核表達載體構(gòu)建
        3.2.3 鵝CD3ε胞外區(qū)基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達及蛋白純化
    3.3 兔抗鵝CD3ε胞外區(qū)多克隆抗體的制備、鑒定及純化
        3.3.1 兔抗鵝CD3ε胞外區(qū)多克隆抗體效價的檢測
        3.3.2 兔抗鵝CD3ε胞外區(qū)多克隆抗體的純化及其Western blot鑒定
        3.3.3 兔抗鵝CD3ε胞外區(qū)多克隆抗體的間接免疫熒光分析
    3.4 抗鵝CD3ε鏈胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的制備與鑒定
        3.4.1 抗鵝CD3ε鏈胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的制備
        3.4.2 雜交瘤細胞的鑒定
    3.5 抗鵝CD3ω鏈胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的初步應(yīng)用
        3.5.1 流式細胞術(shù)檢測鵝CD3⁺T淋巴細胞
        3.5.2 激光共聚焦法檢測鵝CD3⁺T淋巴細胞
4 討論
    4.1 東北白鵝CD3分子ε鏈的克隆與分析
        4.1.1 東北白鵝CD3分子￡鏈的克隆
        4.1.2 東北白鵝CD3ε ORF的序列分析
    4.2 東北白鵝CD3ε胞外區(qū)的表達及多克隆抗體的制備
    4.3 單克隆抗體制備
        4.3.1 免疫原的選擇
        4.3.2 雜交瘤細胞株的篩選方法
    4.4 單克隆抗體的初步應(yīng)用
        4.4.1 流式細胞術(shù)檢測鵝CD3⁺T淋巴細胞
        4.4.2 激光共聚焦法檢測鵝CD3⁺T淋巴細胞
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3963601