試驗(yàn)旨在構(gòu)建雞Prnp基因原核表達(dá)載體,并在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá),為制備雞朊蛋白單克隆抗體提供材料。根據(jù)GenBank已報(bào)道的雞Prnp基因組序列和pET-28a質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,以健康的雞全血基因組DNA為材料,采用PCR的方法擴(kuò)增雞的Prnp基因,將目的基因片段與pET-28a載體連接,構(gòu)建重組原核表達(dá)載體。重組菌轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,并用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定表達(dá)的重組蛋白。結(jié)果表明,重組蛋白在誘導(dǎo)劑的終濃度為0.08 mmol·L^-1,16℃,220 r·min^-1誘導(dǎo)7 h,蛋白表達(dá)量最高。綜上所述,本研究成功構(gòu)建了pET-28a-ChPrnp重組表達(dá)菌株,為Prnp朊蛋白的結(jié)構(gòu)、生理功能和致病機(jī)制研究提供方法。

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圖6重組菌誘導(dǎo)表達(dá)IPTG濃度優(yōu)化

圖5重組菌誘導(dǎo)表達(dá)IPTG溫度優(yōu)化圖7重組菌誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間優(yōu)化

圖7重組菌誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間優(yōu)化

圖6重組菌誘導(dǎo)表達(dá)IPTG濃度優(yōu)化3討論

圖1目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

菌液PCR擴(kuò)增獲得目的DNA片段(圖3),證明在不同連接體系下,目的DNA片段與載體片段都可以成功連接。圖2目的DNA與pET-28a質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物

圖2目的DNA與pET-28a質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物

圖1目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖3重組表達(dá)質(zhì)粒的菌液PCR鑒定

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