豬圓環(huán)病毒2型(PCV2),一種單股環(huán)狀DNA病毒,是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的重要病原之一。PCV2的主要靶細(xì)胞是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng),其所引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征以淋巴細(xì)胞衰竭、炎性細(xì)胞浸潤為特征,造成機(jī)體的免疫功能抑制,繼而易引起其他細(xì)菌和病毒等病原體的繼發(fā)感染,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 泛素蛋白酶體途徑是調(diào)節(jié)真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的重要途徑之一,除了降解細(xì)胞內(nèi)大量蛋白質(zhì)外,其還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和分化、細(xì)胞周期進(jìn)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、炎性反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成等。鑒于泛素蛋白酶體途徑在細(xì)胞內(nèi)重要的生理學(xué)意義,很多病毒利用其來滿足自身需要,如病毒復(fù)制(包括病毒吸附、轉(zhuǎn)錄、翻譯、組裝和釋放)、病毒的免疫逃逸、癌癥進(jìn)程、疾病過程等。目前PCV2感染和泛素蛋白酶體途徑的相互作用尚未見報(bào)道。 本研究首先驗(yàn)證了感染PCV2的豬肺泡巨噬細(xì)胞差異蛋白質(zhì)的表達(dá),然后從泛素蛋白酶體途徑著手,分析了泛素蛋白酶體途徑對(duì)PCV2復(fù)制的影響,以及泛素蛋白酶體途徑相關(guān)的差異蛋白質(zhì)(PSME1和PSMB2)在PCV2致病機(jī)理中的作用。具體研究內(nèi)容如下： 1.蛋白質(zhì)組學(xué)分析感染PCV2的豬肺泡巨噬細(xì)胞差異蛋白質(zhì)的驗(yàn)...

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摘要
Abstract
縮略語表
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬圓環(huán)病毒概述
        1.1.1 PCV1
        1.1.2 PCV2
        1.1.3 PCV生物學(xué)特性
    1.2 PCV2基因組成
        1.2.1 PCV2基因結(jié)構(gòu)
        1.2.2 PCV2蛋白質(zhì)功能
    1.3 病毒復(fù)制
        1.3.1 復(fù)制因子
            1.3.1.1 先導(dǎo)鏈復(fù)制原點(diǎn)
            1.3.1.2 REP復(fù)合物
    1.4 PCV2起源與演化
    1.5 PCV2的傳播途徑
    1.6 PCV2感染與臨床疾病
        1.6.1 豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病
            1.6.1.1 斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征
            1.6.1.2 豬皮炎腎病綜合征
            1.6.1.3 豬呼吸道疾病綜合征
            1.6.1.4 繁殖障礙
            1.6.1.5 肉芽腫性腸炎
            1.6.1.6 滲出性皮炎
            1.6.1.7 壞死性淋巴結(jié)炎
            1.6.1.8 先天性震顫
        1.6.2 與其他病原混合感染
    1.7 PCV2致病機(jī)理
        1.7.1 PCV2復(fù)制機(jī)理
        1.7.2 淋巴細(xì)胞衰竭和免疫抑制
            1.7.2.1 PCV2感染和凋亡
            1.7.2.2 PCV2毒力的基因決定性
            1.7.2.3 免疫增強(qiáng)誘發(fā)PCVAD
        1.7.3 與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用
            1.7.3.1 感染免疫細(xì)胞
            1.7.3.2 IL-10和其他細(xì)胞因子在PCV2感染中的作用
            1.7.3.3 病毒與宿主蛋白的相互作用
            1.7.3.4 病毒DNA與宿主蛋白的相互作用
    1.8 PCV2診斷
    1.9 PCV2疫苗研究進(jìn)展
    1.10 泛素蛋白酶體途徑概述
    1.11 泛素蛋白酶體的組成元件
        1.11.1 泛素
        1.11.2 泛素蛋白酶體途徑相關(guān)的酶
            1.11.2.1 E1激活酶
            1.11.2.2 E2結(jié)合酶
            1.11.2.3 E3連接酶
            1.11.2.4 解離酶
        1.11.3 蛋白酶體
            1.11.3.1 蛋白酶體的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制
            1.11.3.2 蛋白酶體的細(xì)胞定位
        1.11.4 蛋白酶體激活物
            1.11.4.1 PA700
            1.11.4.2 PA28
            1.11.4.3 PA200
        1.11.5 蛋白酶體抑制劑
            1.11.5.1 化學(xué)合成的蛋白酶體抑制劑
            1.11.5.2 天然蛋白酶抑制劑
        1.11.6 靶蛋白泛素化和降解信號(hào)
    1.12 泛素蛋白酶體途徑的功能
        1.12.1 調(diào)節(jié)細(xì)胞周期
        1.12.2 癌癥和細(xì)胞存活
        1.12.3 炎性應(yīng)答
        1.12.4 免疫應(yīng)答
        1.12.5 蛋白的錯(cuò)誤折疊
        1.12.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解
        1.12.7 疾病進(jìn)程
第2章 研究目的與意義
第3章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞、毒株與菌株
        3.1.2 載體與質(zhì)粒
        3.1.3 主要培養(yǎng)基和溶液的配制
        3.1.4 主要試劑與試劑盒
        3.1.5 主要緩沖液與相關(guān)試劑的配制
        3.1.6 主要實(shí)驗(yàn)器材
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 PCV2增殖
        3.2.2 細(xì)胞活力的測定
        3.2.3 病毒感染
        3.2.4 病毒DNA提取
        3.2.5 分子克隆技術(shù)
            3.2.5.1 PCR擴(kuò)增
            3.2.5.2 PCR產(chǎn)物或酶切反應(yīng)的電泳檢測
            3.2.5.3 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的回收
            3.2.5.4 DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)
            3.2.5.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)
            3.2.5.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            3.2.5.7 質(zhì)粒的制備與鑒定
            3.2.5.8 質(zhì)粒的大量制備
            3.2.5.9 質(zhì)粒DNA濃度的測定
        3.2.6 RNA提取
            3.2.6.1 細(xì)胞總RNA的提取
            3.2.6.2 DNase Ⅰ處理
            3.2.6.3 cDNA合成
        3.2.7 實(shí)時(shí)絕對(duì)熒光定量PCR
            3.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備
            3.2.7.2 絕對(duì)熒光定量PCR
        3.2.8 實(shí)時(shí)相對(duì)熒光定量PCR
        3.2.9 轉(zhuǎn)染
        3.2.10 目的蛋白在真核細(xì)胞中表達(dá)的檢測(Western blot方法)
            3.2.10.1 細(xì)胞總蛋白的提取
            3.2.10.2 細(xì)胞核蛋白的提取
            3.2.10.3 SDS-PAGE電泳
            3.2.10.4 Western blot
        3.2.11 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和Sub-G1
        3.2.12 蛋白酶體活性的測定
        3.2.13 NF-κB熒光素酶活性檢測
        3.2.14 間接免疫熒光
        3.2.15 共聚焦技術(shù)
        3.2.16 熒光蛋白標(biāo)記的共定位
        3.2.17 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    4.1 感染PCV2豬肺泡巨噬細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)差異蛋白的驗(yàn)證
        4.1.1 PCV2感染及病毒滴度的測定
        4.1.2 差異蛋白的動(dòng)態(tài)學(xué)變化
        4.1.3 差異蛋白的相對(duì)定量驗(yàn)證
        4.1.4 差異蛋白的Western blot驗(yàn)證
        4.1.5 差異蛋白β-tubulin與PCV2 ORF2共定位分析
    4.2 泛素蛋白酶體途徑對(duì)PCV2復(fù)制的影響
        4.2.1 細(xì)胞活力的測定
        4.2.2 蛋白酶體抑制劑影響PCV2復(fù)制
        4.2.3 蛋白酶體抑制劑對(duì)PCV2不同復(fù)制階段的影響
    4.3 蛋白酶體抑制劑對(duì)細(xì)胞周期的影響
    4.4 PCV2感染對(duì)泛素蛋白酶體途徑的影響
        4.4.1 PCV2感染促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的泛素化
        4.4.2 PCV2感染對(duì)蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的影響
    4.5 針對(duì)泛素的siRNA降低PCV2增殖滴度
    4.6 泛素蛋白酶體途徑相關(guān)蛋白(PSME1和PSMB2)與PCV2的相互作用
        4.6.1 構(gòu)建真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2
            4.6.1.1 基因PSME1和PSMB2的擴(kuò)增
            4.6.1.2 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2的構(gòu)建
            4.6.1.3 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2的鑒定
        4.6.2 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2對(duì)PCV2復(fù)制的影響
            4.6.2.1 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2對(duì)PCV2滴度的影響
            4.6.2.2 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2促進(jìn)ORF2的表達(dá)
        4.6.3 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2對(duì)NF-κB信號(hào)通路的作用
            4.6.3.1 pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2對(duì)NF-κB熒光素酶活性的影響
            4.6.3.2 pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2誘導(dǎo)IκBα的降解和p65的核轉(zhuǎn)位
            4.6.3.3 真核質(zhì)粒pcDNA-PSME1和pcDNA-PSMB2對(duì)炎性因子的影響
        4.6.4 NF-κB信號(hào)通路抑制劑BAY對(duì)PSMB2增強(qiáng)病毒滴度的影響
            4.6.4.1 BAY對(duì)細(xì)胞活力的影響
            4.6.4.2 BAY對(duì)轉(zhuǎn)染PSMB2 PK15細(xì)胞中PCV2滴度的影響
    4.7 PSME1、PSMB2與ORF2、ORF3的共定位
        4.7.1 熒光質(zhì)粒pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3和DsRed-PSME1、DsRed-PSMB2的擴(kuò)增
        4.7.2 重組質(zhì)粒pEGFP-ORF2、ORF3和DsRed-PSME1、PSMB2的構(gòu)建
        4.7.3 熒光質(zhì)粒DsRed-PSME1、PSMB2和pEGFP-ORF2、ORF3的鑒定
        4.7.4 熒光質(zhì)粒pEGFP-ORF2、pEGFP-ORF3和DsRed-PSME1、DsRed-PSMB2的共定位
第5章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 PCV2感染引起豬肺泡巨噬細(xì)胞功能變化
        5.1.2 泛素蛋白酶體途徑是PCV2早期有效復(fù)制所必需的
            5.1.2.1 抑制泛素蛋白酶體途徑降低PCV2滴度
            5.1.2.2 蛋白酶體抑制劑降低PCV2轉(zhuǎn)錄和翻譯
        5.1.3 泛素蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程
        5.1.4 PCV2感染與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化相關(guān)
        5.1.5 PSME1調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)炎性因子
        5.1.6 PSMB2經(jīng)由NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)PCV2增殖
        5.1.7 泛素蛋白酶體途徑和豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號(hào)：3932516