乳脂肪是牛奶的主要營(yíng)養(yǎng)成分,可以為人類提供營(yíng)養(yǎng)和能量,因此生產(chǎn)具有足夠乳脂肪的優(yōu)質(zhì)牛奶是健康食品的發(fā)展趨勢(shì)。然而我國(guó)牛奶中乳脂肪的含量普遍偏低,削弱了乳制品在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力,因此提高乳產(chǎn)量及乳脂肪含量成為我們亟待解決的問(wèn)題。奶牛乳脂肪合成的前體物主要是乙酸和p-羥丁酸,還有乳腺?gòu)难簲z取的長(zhǎng)鏈脂肪酸,以前的研究主要側(cè)重于脂肪酸對(duì)奶牛生產(chǎn)性能的影響,而有關(guān)脂肪酸與乳腺乳脂肪合成功能基因相互作用的研究較少。 本課題首先利用qRT-PCR和Western blotting篩選干奶期奶牛、低乳品質(zhì)奶牛和高乳品質(zhì)奶牛乳腺組織與乳脂肪合成相關(guān)的差異表達(dá)基因和差異表達(dá)蛋白,作為后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用組織塊培養(yǎng)法構(gòu)建奶牛乳腺上皮細(xì)胞(DCMECs)模型。DCMECs添加乙酸鈉、p-羥基丁酸鈉、乙酸鈉和p-羥基丁酸鈉混合物、軟脂酸和硬脂酸,qRT-PCR檢測(cè)DCMECs脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、活化相關(guān)蛋白基因(CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2)、脂肪酸從頭合成、去飽和酶基因(ACC、FAS、SCD)、甘油三酯合成酶相關(guān)基因(GPAT、AGPAT6、DGAT1)和乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(P...

【文章頁(yè)數(shù)】：150 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 乳脂肪合成機(jī)理
        1.1.1 乳脂肪的組成
        1.1.2 乳脂肪酸的組成
        1.1.3 乳脂肪酸的來(lái)源
        1.1.4 乳脂肪合成代謝途徑
    1.2 乳脂肪降低理論
        1.2.1 葡萄糖生成-胰島素理論
        1.2.2 反式脂肪酸理論
        1.2.3 生物氫化作用理論
    1.3. 脂肪合成的轉(zhuǎn)錄因子
        1.3.1 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白
        1.3.2 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體
        1.3.3 肝臟X受體
        1.3.4 乳脂肪合成的轉(zhuǎn)錄因子
    1.4 脂肪酸對(duì)乳脂肪合成的調(diào)節(jié)
    1.5 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 奶牛乳腺組織乳脂肪合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取
        2.2.2 奶牛乳腺組織收集及總RNA提取
        2.2.3 qRT-PCR檢測(cè)乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)
        2.2.4 Western blotting檢測(cè)乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和相關(guān)蛋白表達(dá)
    2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞(DCMECs)的原代培養(yǎng)及鑒定
        2.3.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及純化
        2.3.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定
    2.4 脂肪酸對(duì)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)
        2.4.1 脂肪酸的最佳作用濃度篩選
        2.4.2 脂肪酸作用DCMECs后乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)
        2.4.3 脂肪酸作用DCMECs后乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)
        2.4.4 脂肪酸作用DCMECs后乳脂肪合成關(guān)鍵酶活性的檢測(cè)
    2.5 細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行乳脂肪合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ定位分析
    2.6 脂肪酸添加對(duì)PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)
        2.6.1 脂肪酸的最佳作用濃度篩選
        2.6.2 乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)
        2.6.3 乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的檢測(cè)
        2.6.4 乳脂肪合成關(guān)鍵酶活性的檢測(cè)
    2.7 脂肪酸添加對(duì)PPARγ基因超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)
        2.7.1 引物設(shè)計(jì)及PPARγ基因擴(kuò)增
        2.7.2 PPARγ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆載體構(gòu)建
        2.7.3 真核表達(dá)載體pGCMV/IRES/EGFP/PPARγ的構(gòu)建
        2.7.4 脂肪酸的最佳作用濃度篩選
        2.7.5 乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)
        2.7.6 乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的檢測(cè)
        2.7.7 乳脂肪合成關(guān)鍵酶活性的檢測(cè)
    2.8 數(shù)據(jù)處理
3 結(jié)果與分析
    3.1 奶牛乳腺組織乳脂肪合成相關(guān)基因和相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果
        3.1.1 奶牛乳腺組織乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果
        3.1.2 奶牛乳腺組織乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果
    3.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定
    3.3 脂肪酸對(duì)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.3.1 乙酸鈉對(duì)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.3.2 β-羥基丁酸鈉對(duì)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.3.3 乙酸鈉和β-羥基丁酸鈉協(xié)同作用對(duì)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.3.4 軟脂酸對(duì)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.3.5 硬脂酸對(duì)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
    3.4 乳脂肪合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ定位分析
    3.5 脂肪酸對(duì)PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.5.1 PPARγ RNA沉寂效率
        3.5.2 乙酸鈉對(duì)PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.5.3 β-羥基丁酸鈉對(duì)PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.5.4 乙酸鈉和β-羥基丁酸鈉協(xié)同作用對(duì)PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.5.5 軟脂酸對(duì)PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.5.6 硬脂酸對(duì)PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
    3.6 脂肪酸對(duì)PPARγ基因超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.6.1 PPARγ的PCR擴(kuò)增結(jié)果及重組質(zhì)粒pGCMV/IRES/EGFP/PPARγ的驗(yàn)證
        3.6.2 PPARγ超表達(dá)效率
        3.6.3 乙酸鈉對(duì)PPARγ基因超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.6.4 β-羥基丁酸鈉對(duì)PPARγ基因超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.6.5 乙酸鈉和β-羥基丁酸鈉協(xié)同作用對(duì)PPARγ基因超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.6.6 軟脂酸對(duì)PPARγ基因超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
        3.6.7 硬脂酸對(duì)PPARγ基因超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成影響的檢測(cè)結(jié)果
    3.7 脂肪酸與PPARγ基因互作對(duì)DCMECs乳脂肪合成的調(diào)節(jié)作用示意圖
4 討論
    4.1 不同泌乳質(zhì)量奶牛乳腺組織乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)和蛋白表達(dá)分析
    4.2 脂肪酸對(duì)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.1 乙酸鈉對(duì)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.2 β-羥基丁酸鈉對(duì)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.3 乙酸鈉和β-羥基丁酸鈉協(xié)同作用對(duì)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.4 軟脂酸對(duì)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.5 硬脂酸對(duì)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.6 脂肪酸對(duì)DCMECs乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用
    4.3 PPARγ細(xì)胞內(nèi)定位分析
    4.4 PPARγ基因沉寂和超表達(dá)對(duì)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.4.1 PPARγ基因沉寂對(duì)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.4.2 PPARγ基因超表達(dá)對(duì)DCMECs乳脂肪合成的影響
    4.5 脂肪酸對(duì)PPARγ基因沉寂和超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.5.1 乙酸鈉對(duì)PPARγ基因沉寂和超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.5.2 β-羥基丁酸鈉對(duì)PPARγ基因沉寂和超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.5.3 乙酸鈉和β-羥基丁酸鈉協(xié)同作用對(duì)PPARγ基因沉寂和超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.5.4 軟脂酸對(duì)PPARγ基因沉寂和超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.5.5 硬脂酸對(duì)PPARγ基因沉寂和超表達(dá)DCMECs乳脂肪合成的影響
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3919526