斯鈣素1(Stanniocalcin1, STC-1)是一種最初在硬骨魚類發(fā)現(xiàn)的低鈣性激素,在魚類它是由緊鄰腎臟而且在整個腎臟中均有分布的特殊器官—斯坦尼氏小體所分泌,該激素主要通過調(diào)節(jié)腮、小腸和腎臟Ca2+和無機磷酸鹽(Inorganic phosphate, Pi)的轉(zhuǎn)運來發(fā)揮其抗高鈣效應(yīng)。哺乳動物體內(nèi),STC-1在多種器官中均有表達,包括Ca2+吸收上皮如小腸、回腸、腎臟、胎盤以及其它血管化組織。哺乳動物STC-1是一多功能效應(yīng)蛋白,如它能調(diào)節(jié)腎臟和腸道Ca2+/Pi吸收,小鼠中其超表達可致高血Pi、侏儒癥、代謝率增加等效應(yīng),近來發(fā)現(xiàn)它和癌癥也有一定的聯(lián)系。STC-1的表達受1,25(OH)2D3等理化因素調(diào)節(jié)。然而,STC-1在哺乳動物中的多種生理作用還未完全清楚,還有待進一步研究。 1.原核表達牛源STC-1重組蛋白 本試驗以奶牛腎臟組織提取的總RNA合成cDNA,然后使用PCR技術(shù)擴增出除信號肽序列外的奶牛STC-1全長結(jié)構(gòu)基因。利用T-A克隆原理將擴增產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞,經(jīng)過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行擴大培養(yǎng),然后將菌液進行測序。結(jié)果表明該...

【文章頁數(shù)】：135 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表
單位
第一部分 文獻綜述
    第一章 斯鈣素1研究進展
        1.1 STC發(fā)現(xiàn)歷程
        1.2 魚類STC
            1.2.1 基因表達調(diào)節(jié)
            1.2.2 STC靶器官和作用機制
        1.3 STC家族
            1.3.1 哺乳動物STC-1的發(fā)現(xiàn)
            1.3.2 哺乳動物STC-1表達和分布
        1.4 哺乳動物STC-1生理功能
            1.4.1 轉(zhuǎn)基因和基因敲除研究
            1.4.2 Ca²⁺/Pi穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)
            1.4.3 對動物發(fā)育和亞細胞功能的作用
        1.5 斯鈣素和癌癥
            1.5.1 斯鈣素和癌癥的關(guān)系
            1.5.2 STC-1在血管生成、細胞增殖和凋亡中的作用
            1.5.3 STC-1和腫瘤微環(huán)境
        1.6 總結(jié)
    第二章 鈣離子轉(zhuǎn)運概述
        2.1 機體Ca²⁺代謝
        2.2 機體Ca²⁺調(diào)節(jié)
        2.3 機體Ca²⁺轉(zhuǎn)運概述
            2.3.1 細胞旁路轉(zhuǎn)運途徑
            2.3.2 跨細胞轉(zhuǎn)運
    第三章 新型鈣離子通道研究進展
        3.1 TRPV5和TRPV6
            3.1.1 上皮細胞TRPV5和TRPV6分布
            3.1.2 TRPV5和TRPV6的分子特征
        3.2 Calbindin-D_28K和Calbindin-D9K

        3.3 NCX和PMCA
第二部分 試驗研究
    第四章 原核表達牛源斯鈣素1重組蛋白研究
        摘要
        Abstract
        4.1 研究背景
        4.2 材料和方法
            4.2.1 實驗動物
            4.2.2 試驗材料和試劑
            4.2.3 克隆奶牛斯鈣素1基因
            4.2.4 擴增產(chǎn)物的TA克隆
            4.2.5 構(gòu)建STC-1原核表達載體
            4.2.6 STC-1融合蛋白誘導(dǎo)表達
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 STC-1基因的擴增和克隆
            4.3.2 RCR和酶切檢測重組質(zhì)粒pMD18-STC-1和pET-STC-1
            4.3.3 重組質(zhì)粒pET-STC-1 DNA測序
            4.3.4 SDS-PAGE電泳分析表達產(chǎn)物
        4.4 討論
    第五章 斯鈣素1蛋白在奶牛胃腸道差異性表達情況研究
        摘要
        Abstract
        5.1 研究背景
        5.2 材料與方法
            5.2.1 實驗動物
            5.2.2 實驗試劑
            5.2.3 儀器設(shè)備
            5.2.4 半定量Real-time PCR
            5.2.5 細胞蛋白提取及蛋白含量測定
            5.2.6 免疫印跡分析
            5.2.7 數(shù)據(jù)分析
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 STC-1基因的擴增曲線和融解曲線
            5.3.2 總蛋白濃度測定
            5.3.3 STC-1基因在奶牛胃腸道和腎臟的表達情況
            5.3.4 STC-1蛋白在奶牛胃腸道和腎臟的表達情況
        5.4 討論
    第六章 新生牛小腸上皮細胞培養(yǎng)方法建立
        摘要
        Abstract
        6.1 前言
        6.2 材料和方法
            6.2.1 實驗試劑
            6.2.2 主要試驗儀器和設(shè)備
            6.2.3 無菌操作
            6.2.4 分離小腸上皮細胞
            6.2.5 純化小腸上皮細胞
            6.2.6 小腸上皮細胞形態(tài)學(xué)觀察
            6.2.7 鑒定小腸上皮細胞
            6.2.8 PCR
        6.3 結(jié)果
            6.3.1 上皮細胞形態(tài)學(xué)觀察
            6.3.2 電鏡和染色觀察上皮細胞
            6.3.3 免疫細胞化學(xué)鑒定上皮細胞
            6.3.4 PCR鑒定上皮細胞
        6.4 討論
    第七章 斯鈣素1對過氧化氫誘導(dǎo)的奶牛腸道上皮細胞損傷的保護作用研究
        摘要
        Abstract
        7.1 研究背景
        7.2 材料和方法
            7.2.1 實驗試劑和材料
            7.2.2 主要儀器
            7.2.3 新生牛小腸上皮細胞培養(yǎng)
            7.2.4 構(gòu)建pcDNA-STC-1重組質(zhì)粒的
            7.2.5 細胞處理
            7.2.6 吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染色
            7.2.7 細胞存活率檢測
            7.2.8 Real-timePCR基因表達分析
            7.2.9 Westem blotting
            7.2.10 數(shù)據(jù)分析
        7.3 實驗結(jié)果
            7.3.1 轉(zhuǎn)染細胞中STC-1表達情況
            7.3.2 H₂O₂誘導(dǎo)的細胞損傷
            7.3.3 H₂O₂誘導(dǎo)的細胞死亡
            7.3.4 H₂O₂誘導(dǎo)的STC-1表達
            7.3.5 STC-1超表達對H₂O₂誘導(dǎo)的損傷的作用
            7.3.6 STC-1超表達對凋亡相關(guān)蛋白表達的作用
        7.4 討論
    第八章 斯鈣素1對Caco₂細胞新型鈣離子轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)節(jié)作用研究
        摘要
        Abstract
        8.1 研究背景
        8.2 材料和方法
            8.2.1 試驗材料和試劑
            8.2.2 細胞培養(yǎng)
            8.2.3 構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pIRES-STC-1
            8.2.4 STC-1基因siRNA設(shè)計和合成
            8.2.5 細胞處理和重組質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染
            8.2.6 Real-time PCR
            8.2.7 Western blotting
            8.2.8 數(shù)據(jù)分析
        8.3 結(jié)果
            8.3.1 轉(zhuǎn)染后Caco2細胞中STC-1表達情況
            8.3.2 STC-1超表達對Ca²⁺轉(zhuǎn)運蛋白的影響
            8.3.3 STC-1表達抑制對Ca²⁺轉(zhuǎn)運蛋白的影響
        8.4 討論
參考文獻
致謝
附錄



本文編號：3911638

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