水牛是我國(guó)南方非常重要的役用動(dòng)物,肉用和乳用潛力很大,但是水牛繁殖性能和泌乳性能低下。抑制素(inhibin,INH)負(fù)反饋調(diào)控FSH的合成與分泌,降低水牛的繁殖性能；水牛妊娠期長(zhǎng)而且實(shí)驗(yàn)成本高,因此,我們以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物模型,開展水牛INH的RNAi的干擾效果的研究,為生產(chǎn)具有高繁殖性能的轉(zhuǎn)基因水牛提供參考。在本研究中,我們以水牛INHA為靶基因構(gòu)建RNAi載體,在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞上進(jìn)行干擾效果的分析,篩選出干擾效果較好的RNAi片段,隨后應(yīng)用顯微注射技術(shù)將該片段整合到小鼠基因組中,以進(jìn)一步在轉(zhuǎn)基因RNA i小鼠中分析該片段的干擾效果,為高繁殖力轉(zhuǎn)基因水牛的研究打下基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下：(1)根據(jù)水牛INHA(EU884446.1) mRNA CDS設(shè)計(jì)四條s hRNA,分別命名為：shRNA-b1, shRNA-b2, shRNA-b3和shRNA-b4(陰性對(duì)照)。(2)利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體phi5,成功構(gòu)建了四個(gè)RNAi干擾表達(dá)載體,分別命名為：phi5siRNA-b1, phi5siRNA-b2, phi5siRNA-b3 和 phi5siRNA-b4(陰性對(duì)照...

【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表(Abbreviation words)
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 抑制素的研究進(jìn)展
        1.1.1 抑制素基因的結(jié)構(gòu)和組織分布
        1.1.2 抑制素基因的功能
        1.1.3 抑制素基因在生產(chǎn)上的應(yīng)用
    1.2 轉(zhuǎn)基因RNAi小鼠的研究現(xiàn)狀
        1.2.1 RNAi的作用機(jī)理和特性
        1.2.2 RNAi體外制備方法
        1.2.3 RNAi技術(shù)的用途及發(fā)展前景
        1.2.4 RNAi在轉(zhuǎn)基因小鼠上的應(yīng)用
    1.3 研究目的和意義
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠和細(xì)胞
        2.1.3 主要試劑耗材
        2.1.4 相關(guān)溶液的配制
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 shRNA序列設(shè)計(jì)與合成
        2.2.2 phi5siRNA載體的構(gòu)建與鑒定
        2.2.3 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.2.4 重組載體轉(zhuǎn)染小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的條件優(yōu)化
        2.2.5 重組載體轉(zhuǎn)染小鼠卵巢顆粒細(xì)胞
        2.2.6 重組載體對(duì)INHA基因抑制效率的測(cè)定
        2.2.7 重組載體的線性化酶切與顯微注射
        2.2.8 轉(zhuǎn)基因RNAi小鼠的PCR鑒定
3 結(jié)果與分析
    3.1 shRNA序列設(shè)計(jì)
    3.2 phi5siRNA載體的構(gòu)建與鑒定
        3.2.1 phi5空載體的線性化雙酶切
        3.2.2 重組載體的酶切鑒定
        3.2.3 重組載體的測(cè)序鑒定
    3.3 重組載體轉(zhuǎn)染小鼠卵巢顆粒細(xì)胞條件的優(yōu)化
    3.4 重組載體轉(zhuǎn)染小鼠卵巢顆粒細(xì)胞
    3.5 重組載體干擾效率的測(cè)定
        3.5.1 RNA的質(zhì)量檢測(cè)
        3.5.2 定量引物RT-PCR擴(kuò)增效果檢測(cè)
        3.5.3 熒光定量PCR(qPCR)的檢測(cè)結(jié)果
    3.6 用于轉(zhuǎn)基因小鼠制作的載體的線性化酶切
    3.7 轉(zhuǎn)基因RNAi小鼠的PCR鑒定
4 討論
    4.1 關(guān)于phi5載體的使用
    4.2 關(guān)于phi5siRNA載體的構(gòu)建方法
    4.3 關(guān)于小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)
    4.4 關(guān)于靶序列的選擇背景和干擾效果的討論
    4.5 關(guān)于轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的鑒定
5 結(jié)論
6 創(chuàng)新點(diǎn)、不足和下一步研究計(jì)劃
參考文獻(xiàn)
附錄
在校期間發(fā)表文章、專利
致謝



本文編號(hào)：3909472