為了提高H5N8亞型禽流感病毒核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,試驗(yàn)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19438.1—2004和GB/T 19438.2—2004選出禽流感病毒H5N8亞型毒株,根據(jù)HA和NA基因全長(zhǎng)序列分別設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增;利用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)制備出H5N8亞型禽流感病毒檢測(cè)用核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),并測(cè)定其濃度和純度;采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對(duì)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物HA-cRNA、NA-cRNA進(jìn)行驗(yàn)證并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;檢測(cè)HA-cRNA、NA-cRNA的均勻性和穩(wěn)定性,并通過協(xié)作標(biāo)定方式對(duì)其含量及不確定度進(jìn)行分析。結(jié)果表明:H5N8亞型禽流感病毒HA和NA基因片段大小為1 704 bp和1 413 bp,與預(yù)期大小一致。H5N8亞型禽流感病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)HA基因的OD₂₆₀/OD₂₈₀值為1.93,濃度為11.32 ng/μL;NA基因的OD₂₆₀/OD₂₈₀值為2.06,濃度為14.24 ng/μL。體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物HA-cRNA、NA-cRNA均有典型的擴(kuò)增曲線,HA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-3.59...

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【文章目錄】：
1 材料
    1.1 毒株
    1.2 主要試劑與菌株
2 方法
    2.1 毒株選定與引物設(shè)計(jì)
    2.2 HA和NA基因擴(kuò)增和克隆
    2.3 HA和NA基因體外轉(zhuǎn)錄
    2.4 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度及純度的測(cè)定
    2.5 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物驗(yàn)證
    2.6 均勻性試驗(yàn)
    2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)
    2.8 聯(lián)合標(biāo)定與不確定度分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 HA和NA基因擴(kuò)增
    3.2 重組質(zhì)粒擴(kuò)增
    3.3 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度、純度測(cè)定
    3.4 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物驗(yàn)證
    3.5 均勻性試驗(yàn)
    3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)
    3.7 聯(lián)合標(biāo)定和不確定度分析
4 討論與結(jié)論



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