發(fā)布時間：2023-11-04 11:49

　　如何水解自然界中最豐富的碳水化合物——纖維素是一個重要課題,纖維素的水解依賴于內切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC3.2.1.74)、纖維二糖水解酶(EC3.2.1.176)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)的協(xié)同作用。其中β-葡萄糖苷酶將纖維二糖或寡糖水解為非還原末端的葡萄糖,可有效減輕纖維素酶水解過程中纖維二糖對纖維素酶活性的抑制,提高纖維素降解效果。課題組前期從反芻動物綿羊瘤胃中分離篩選到一株可降解纖維素的糞腸球菌CTB(Enterococcus faecalis CTB),并且檢測到該菌株具有β-葡萄糖苷酶活性。為了探究糞腸球菌為何會有β-葡萄糖苷酶活性,該酶有何特點或特殊性,對該菌株進行了基因組完成圖測序,結果表明具有多條β-葡萄糖苷酶基因,從中選取兩條代表性基因進行PCR擴增,以E.coli BL21(DE3)為宿主對蛋白進行表達,表達的蛋白分別命名為bgl1213和bgl2557。bgl1213顯示出β-葡萄糖苷酶活性,bgl2557展現(xiàn)出β-半乳糖苷酶活性。CTB-2557表達的最優(yōu)條件為:最適溫度30℃,最適培養(yǎng)時間12 h,IPTG濃度1.2...

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 引言
    1.2 β-葡萄糖苷酶簡介
    1.3 β-葡萄糖苷酶分類
        1.3.1 根據(jù)底物特異性對β-葡萄糖苷酶進行分類
        1.3.2 根據(jù)核苷酸序列同一性(NSI)對β-葡萄糖苷酶進行分類
    1.4 β-葡萄糖苷酶活性及作用底物
    1.5 產β-葡萄糖苷酶的微生物
        1.5.1 產β-葡萄糖苷酶的細菌
        1.5.2 產β-葡萄糖苷酶的真菌
    1.6 β-葡萄糖苷酶的克隆及異源表達
    1.7 β-葡萄糖苷酶的應用
        1.7.1 β-葡萄糖苷酶在生物乙醇生產中的重要作用
        1.7.2 β-葡萄糖苷酶在食品中的重要作用
        1.7.3 β-葡萄糖苷酶在醫(yī)藥中的作用
    1.8 課題的研究意義及內容
        1.8.1 課題的研究意義
        1.8.2 技術路線圖
第二章 Enterococcus faecalis CTBβ-葡萄糖苷酶基因的克隆
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 實驗儀器和試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 菌株培養(yǎng)
        2.2.2 Enterococcus faecalis CTB基因組提取
        2.2.3 引物設計
        2.2.4 PCR擴增β-葡萄糖苷酶基因片段
        2.2.5 克隆載體的構建
        2.2.6 重組質粒的轉化
    2.3 結果與討論
        2.3.1 Enterococcus faecalis CTBβ-葡萄糖苷酶基因的克隆及回收
        2.3.2 陽性克隆菌株的鑒定
        2.3.3 序列測定及分析
    2.4 小結
第三章 Enterococcus faecalis CTBβ-葡萄糖苷酶基因的表達
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株和質粒
        3.1.2 培養(yǎng)基
        3.1.3 實驗試劑和儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 表達載體的構建
        3.2.2 重組蛋白在大腸桿菌中的誘導表達
        3.2.3 酶活測定
        3.2.4 誘導溫度對產酶的影響
        3.2.5 誘導時間對產酶的影響
        3.2.6 IPTG濃度對產酶的影響
    3.3 結果與討論
        3.3.1 重組子的篩選及鑒定
        3.3.2 重組菌株在大腸桿菌中的誘導表達
    3.4 小結
第四章 重組β-葡萄糖苷酶的純化及性質研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株、培養(yǎng)基
        4.1.2 實驗試劑和儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 粗酶液的制備
        4.2.2 純化重組β-葡萄糖苷酶
        4.2.3 SDS-PAGE凝膠檢測
        4.2.4 濃縮重組β-葡萄糖苷酶
        4.2.5 bgl1213 的酶學性質研究
    4.3 結果與討論
        4.3.1 bgl1213 的純化結果
        4.3.2 bgl1213 酶學性質分析
    4.4 小結
第五章 重組β-半乳糖苷酶的純化及性質研究
    5.1 實驗材料
        5.1.1 菌株和培養(yǎng)基
        5.1.2 實驗試劑和儀器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 粗酶液的制備
        5.2.2 純化重組β-半乳糖苷酶
        5.2.3 SDS-PAGE凝膠檢測
        5.2.4 濃縮重組β-半乳糖苷酶
        5.2.5 bgl2557 的酶學性質研究
    5.3 結果與討論
        5.3.1 bgl2557 的純化結果
        5.3.2 bgl2557 的酶學性質研究結果
    5.4 小結
總結與展望
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3860248