現(xiàn)代社會不斷發(fā)展,隨之出現(xiàn)的問題是社會經(jīng)濟(jì)增長與環(huán)境保護(hù)、生存發(fā)展與能源消耗之間的矛盾愈發(fā)突出。傳統(tǒng)能源的開采力度不斷增加,使許多不可再生資源總量不斷減少,所帶來的污染問題也愈發(fā)嚴(yán)重,目前最急迫需要解決的問題便是努力探索和發(fā)展新能源,而生物質(zhì)能源作為新生代能源之一,將為人類社會解決能源與環(huán)境問題做出卓越貢獻(xiàn)。本研究通過提取芒草馴養(yǎng)的湘西黃牛瘤胃內(nèi)容物總DNA,構(gòu)建宏基因組文庫并采用功能篩選法從文庫中挖掘新型纖維素酶基因資源,獲得研究結(jié)果如下： 應(yīng)用功能篩選法篩選宏基因組文庫中具有CMCase的克隆,得到一個功能活性克隆,編號為185C10。對此克隆包含的外源片段進(jìn)一步進(jìn)行亞克隆,最終獲得一段2162bp的核苷酸序列,經(jīng)過生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析,該片段包含長為1731bp的ORF,將該基因定名為uncel185C10,編碼576個氨基酸,該基因編碼蛋白Uncel185C10的分子質(zhì)量為62654.2Daltons,等電點(diǎn)pI為4.90,該編碼蛋白無信號肽序列,說明uncel185C10可能編碼的是胞內(nèi)酶。通過SMART分析,結(jié)果預(yù)測該蛋白中第1-300個氨基酸是糖基水解酶家族8高度保守結(jié)...

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
第一章 文獻(xiàn)綜述及前言
    1 能源植物—芒草的研究與發(fā)展戰(zhàn)略
        1.1“綠金”代“黑金”的必然性
        1.2 能源植物新秀—芒草
        1.3 我國能源植物芒草的發(fā)展戰(zhàn)略
    2 瘤胃未培養(yǎng)微生物及纖維素分解菌
        2.1 未培養(yǎng)微生物
        2.2 瘤胃微生物
            2.2.1 瘤胃細(xì)菌
            2.2.2 瘤胃原蟲
            2.2.3 瘤胃真菌
            2.2.4 瘤胃微生物基因組信息
    3 瘤胃微生物纖維素酶
        3.1 瘤胃微生物纖維素酶的組成
        3.2 芒草馴養(yǎng)對發(fā)掘牛瘤胃微生物纖維素酶的意義
    4 宏基因組學(xué)——探索未培養(yǎng)微生物資源的重要途徑
        4.1 宏基因組學(xué)研究策略
        4.2 宏基因組學(xué)研究應(yīng)用進(jìn)展
            4.2.1 在胃腸道微生物資源挖掘上的應(yīng)用
            4.2.2 在口腔微生物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用
            4.2.3 在植物病害生物防治中的應(yīng)用
            4.2.4 在自然環(huán)境微生物資源挖掘上的應(yīng)用
        4.3 宏基因組技術(shù)存在的問題及展望
    5 本論文立題依據(jù)、研究目標(biāo)及技術(shù)路線
        5.1 題依據(jù)
        5.2 研究目標(biāo)
        5.3 技術(shù)路線
第二章 材料與方法
    1 材料
        1.1 實驗動物及飼養(yǎng)
        1.2 實驗儀器設(shè)備
        1.3 實驗藥品及試劑
    2 方法
        2.1 宏基因組Fosmid文庫克隆子的提取和保存
            2.1.1 Fosmid文庫克隆子的提取
            2.1.2 Fosmid文庫克隆子的保存
        2.2 Fosmid文庫篩選
        2.3 克隆文庫的構(gòu)建
            2.3.1 Fosmid克隆質(zhì)粒的提取
            2.3.2 pUC質(zhì)粒載體制備
            2.3.3 目的片段酶切產(chǎn)物與pUC19載體的連接
            2.3.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.3.5 克隆文庫的篩選
        2.4 菌液PCR檢測
        2.5 功能基因序列分析
        2.6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.6.1 擴(kuò)增功能基因的編碼序列
            2.6.2 PCR擴(kuò)增
            2.6.3 pET30a(+)質(zhì)粒載體的提取
            2.6.4 制備感受態(tài)
            2.6.5 酶切體系
            2.6.6 目的基因片段與表達(dá)載體DNA連接及轉(zhuǎn)化
        2.7 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
            2.7.1 最佳誘導(dǎo)劑劑量的確定
            2.7.2 最佳誘導(dǎo)溫度的確定
            2.7.3 最佳誘導(dǎo)時間的確定
        2.8 CMCase酶學(xué)性質(zhì)初步研究
            2.8.1 CMCase酶活力的測定
            2.8.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
            2.8.3 酶活測定
            2.8.4 粗酶液最適pH值的測定
            2.8.5 粗酶液最適反應(yīng)溫度的測定
            2.8.6 熱穩(wěn)定性的研究
            2.8.7 pH穩(wěn)定性的研究
            2.8.8 金屬離子對酶活力的影響
第三章 結(jié)果與分析
    1 Fosmid文庫的篩選
    2 亞克隆文庫構(gòu)建與篩選
        2.1 目的片段酶切產(chǎn)物與pUC19載體的連接
        2.2 亞克隆文庫篩選結(jié)果
        2.3 菌液PCR檢測
    3 亞克隆序列分析
        3.1 序列及其編碼氨基酸序列分析
        3.2 理化性質(zhì)分析
        3.3 功能結(jié)構(gòu)域分析
        3.4 信號肽分析
        3.5 Uncel185C10系統(tǒng)進(jìn)化分析
    4 功能基因的原核表達(dá)
        4.1 構(gòu)建目的基因表達(dá)載體
        4.2 重組質(zhì)粒酶切驗證
        4.3 基因工程菌功能驗證
    5 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
        5.1 最佳誘導(dǎo)劑劑量的確定
        5.2 最佳誘導(dǎo)溫度的確定
        5.3 最佳誘導(dǎo)時間的確定
    6 CMCase酶學(xué)性質(zhì)分析
        6.1 最適反應(yīng)pH的確定
        6.2 最適反應(yīng)溫度的確定
        6.3 CMCase的pH穩(wěn)定性
        6.4 CMCase的溫度穩(wěn)定性
        6.5 金屬離子對酶活力
第四章 討論
第五章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)及下一步工作計劃
    1 結(jié)論
    2 創(chuàng)新點(diǎn)
    3 下一步工作計劃
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介



本文編號：3821287