由于禽類獨(dú)特的生殖系統(tǒng),一個(gè)新生種雞蛋已經(jīng)是一個(gè)包含六萬個(gè)左右細(xì)胞的雞胚。雞蛋的外殼堅(jiān)硬,雞蛋黃大而脆弱,不像哺乳動(dòng)物的卵子是透明的從而便于顯微注射操作。近年來隨著慢病毒的廣泛應(yīng)用和雞原始生殖細(xì)胞的成功培養(yǎng),轉(zhuǎn)基因雞的制備主要使用慢病毒注射和雞原始生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)移法這兩種方法,獲得的Go代轉(zhuǎn)基因雞外源基因的嵌合率高達(dá)52.2%。目前有細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶,人類單克隆抗體和單鏈Fv-Fc融合蛋白等幾種重組蛋白成功地在轉(zhuǎn)基因雞蛋清中表達(dá),本研究成功地利用慢病毒制備了在蛋清中表達(dá)重組人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因雞。 溶菌酶(LY)又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶,廣泛存在于牛奶,唾液,哺乳動(dòng)物淚水以及禽類蛋白中。雞溶菌酶(cLY)由129個(gè)氨基酸殘基組成,分子質(zhì)量為14.3kDa,人溶菌酶(hLV)由130個(gè)氨基酸殘基組成,分子質(zhì)量為14.7kDa,這兩種蛋白的組成氨基酸有59%的同源性。盡管這兩種溶菌酶的組成如此相近,人溶菌酶的抗菌活性卻是雞溶菌酶的三倍。人溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效,并且對(duì)人體完全無毒害、無副作用,是一種安全的抗感染物質(zhì)和天然防腐劑,也是嬰兒食品、飲料的良好添加劑。然而,天然...

【文章頁數(shù)】：127 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 轉(zhuǎn)基因雞研究進(jìn)展
        引言
        1.1.1 受精卵操作法
        1.1.2 利用胚胎干細(xì)胞制備嵌合體
        1.1.3 原始生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)移法制備生殖系嵌合體
        1.1.4 利用病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因
    1.2 慢病毒載體研究進(jìn)展
        引言
        1.2.1 慢病毒
        1.2.2 慢病毒載體
        1.2.3 慢病毒載體的發(fā)展歷程
        1.2.4 慢病毒假型化包膜的發(fā)展歷程
        1.2.5 慢病毒載體的制備
        1.2.6 慢病毒載體的應(yīng)用
    1.3 溶菌酶研究簡(jiǎn)介
        1.3.1 溶菌酶的分類
        1.3.2 重組人溶菌酶研究
    1.4 本研究的目的和技術(shù)路線
        1.4.1 研究目的
        1.4.2 技術(shù)路線
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 細(xì)胞系
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)雞蛋和種母雞
        2.1.4 主要試劑
        2.1.5 試劑的配制
        2.1.6 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材
        2.1.7 實(shí)驗(yàn)分析軟件
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
        2.2.3 DNA片段的連接
        2.2.4 質(zhì)粒DNA的制備
        2.2.5 PCR產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物的膠回收
        2.2.6 PCR反應(yīng)
        2.2.7 菌落PCR法
        2.2.8 總RNA的提取(Trizol法)
        2.2.9 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        2.2.10 HotSHOT提取DNA法
        2.2.11 DNA的提取
        2.2.12 Southern Blot
        2.2.13 細(xì)胞蛋白提取
        2.2.14 蛋白定量
        2.2.15 Western Blot
        2.2.16 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.17 病毒包裝流程(Fugene HD轉(zhuǎn)染方法)
        2.2.18 病毒滴度測(cè)定
        2.2.19 Genome Walking
        2.2.20 ELISA測(cè)定人溶菌酶含量
        2.2.21 免疫熒光
        2.2.22 替代殼制備
        2.2.23 雞胚顯微注射(胚盤下腔注射)
        2.2.24 第一次換殼操作
        2.2.25 第二次換殼操作
        2.2.26 雞胚孵化
        2.2.27 雞的采精與輸精
第三章 G₀代嵌合體雞的制備和檢測(cè)
    引言
    3.1 載體構(gòu)建
        3.1.1 載體構(gòu)建的策略
        3.1.2 ERE和OV的克隆
        3.1.3 人工合成人溶菌酶cDNA序列
        3.1.4 慢病毒載體構(gòu)建
    3.2 慢病毒包裝
        3.2.1 慢病毒制備
        3.2.2 慢病毒滴度測(cè)定
    3.3 雞胚注射及培養(yǎng)
        3.3.1 雞胚注射
        3.3.2 雞胚培養(yǎng)
        3.3.3 雞胚注射及培養(yǎng)結(jié)果
    3.4 G₀代雞外源基因檢測(cè)
        3.4.1 G₀代雞胚檢測(cè)
        3.4.2 G₀代育成期雞檢測(cè)
第四章 轉(zhuǎn)人溶菌酶雞的制備和檢測(cè)
    引言
    4.1 G₀代公雞精液外源基因檢測(cè)
    4.2 G₀代公雞的傳代
    4.3 G₁代轉(zhuǎn)基因雞鑒定
        4.3.1 PCR鑒定
        4.3.2 Southern Blot鑒定
        4.3.3 Genome Walking鑒定轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)
    4.4 G₁代轉(zhuǎn)基因母雞蛋白檢測(cè)
    4.5 G₁代轉(zhuǎn)基因雞的傳代
    4.6 G₂代轉(zhuǎn)基因母雞蛋白檢測(cè)
    4.7 重組人溶菌酶在雞輸卵管特異性表達(dá)檢測(cè)
        4.7.1 RT-PCR檢測(cè)hLY的轉(zhuǎn)錄情況
        4.7.2 免疫熒光檢測(cè)hLY在雞輸卵管的表達(dá)情況
    4.8 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3818201