隨著工業(yè)的發(fā)展,環(huán)境中的鎘通過消化道和呼吸道進(jìn)入生物體內(nèi)引起鎘的慢性蓄積。骨骼是鎘毒性作用的重要靶器官,長期低劑量的鎘暴露引起骨密度下降,抑制骨礦化。研究表明,鎘能增加成骨細(xì)胞RANKL的表達(dá),同時(shí)抑制骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞(OC)的分化,同時(shí)鎘也能促進(jìn)破骨細(xì)胞前體RAW264.7細(xì)胞向OC分化,但鎘調(diào)控OC分化的分子機(jī)制尚不清楚。鈣離子是細(xì)胞中重要的生理調(diào)節(jié)因子,可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等。本文以5-6周齡C57BL/6小鼠的骨髓巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)形成OC,研究不同濃度鎘處理對OC分化的影響,以及鈣離子和CaM/CaMKs信號在鎘影響OC分化的作用機(jī)制。1.鎘對OC分化的影響采集5-6周齡C57BL/6雄性小鼠骨髓巨噬細(xì)胞,以0、20、50、100nM的鎘加入含有30 ng/ml M-CSF 和 60 ng/ml RANKL 的 α-MEM 培養(yǎng)基,培養(yǎng) 5d 后,TRAP 染色鑒定 OC的形成數(shù)量,Western blot檢測OC中NFATcl、TRAP、CAII、CK蛋白表達(dá)水平,RT-qPCR檢測OC相關(guān)基因NFATcl、TRAP、c-Fos、CAII的表達(dá)...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號說明
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 鎘毒性作用及分子機(jī)制的研究進(jìn)展
        1.鎘的毒性損傷機(jī)制
        2.鎘的毒性作用
        3.鎘對骨骼及破骨細(xì)胞的毒性作用
    第二章 OC分化的研究進(jìn)展
        1. M-CSF/c-Fms通路與OCP分化的調(diào)控
        2. RANKL/RANK/OPG通路在OC分化中的作用
    第三章 鈣離子信號及Ca²⁺/CaM/CaMKs信號通路
        1. 鈣離子在細(xì)胞中的作用
            1.1 鈣離子動(dòng)員
            1.2 鈣離子振蕩
            1.3 Ca²⁺/CaM/CaMKs
        2. Ca²⁺/CaM/CaMKs在OC分化中的作用
第二部分 試驗(yàn)研究
    第一章 鎘對小鼠OC分化的影響
        1. 材料和方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2. 方法
            2.1 骨髓單核細(xì)胞的分離及OC的誘導(dǎo)分化
            2.2 骨髓單核細(xì)胞活性的測定
            2.3 TRAP染色及計(jì)數(shù)
            2.4 蛋白樣品提取
            2.5 Western blot方法測定相關(guān)蛋白
            2.6 RNA樣品提取
            2.7 引物設(shè)計(jì)與合成
            2.8 互補(bǔ)脫氧核苷酸(cDNA)制備
            2.9 基因組DNA消除反應(yīng)
            2.10 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
            2.11 RT-qPCR
            2.12 數(shù)據(jù)分析
        3. 結(jié)果
            3.1 RTCA法檢測鎘對骨髓巨噬細(xì)胞活性的影響
            3.2 TRAP染色法觀察鎘對OC形成的影響
            3.3 RT-qCR檢測鎘對OC相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)的影響
            3.4 Western blot檢測鎘對OC相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響
            3.5 討論
    第二章 鈣離子信號在鎘影響OC分化過程中的作用
        1. 材料和方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2. 方法
            2.1 骨髓單核細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            2.2 OC的誘導(dǎo)
            2.3 TRAP染色及計(jì)數(shù)
            2.4 蛋白樣品提取
            2.5 Western blot方法
            2.6 激光共聚焦顯微鏡檢測鈣離子
            2.7 數(shù)據(jù)分析
        3. 結(jié)果
            3.1 激光共聚焦顯微鏡檢測鎘對胞內(nèi)鈣離子濃度的影響
            3.2 激光共聚焦顯微鏡檢測鎘和BAPTA-AM對胞內(nèi)鈣離子濃度的影響
            3.3 TRAP染色法觀察鈣離子在鎘對OC分化中的作用
            3.4 Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM在鎘影響OC分化過程中的作用
            3.5 Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子抑制劑TG(Thapsigargin)調(diào)控OC分化過程中的作用
            3.6 Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子抑制劑2-APB對OC分化過程中的影響
        4. 討論
    第三章 Ca²⁺/CaM/CaMKs信號通路在鎘影響OC分化過程中的作用
        1. 材料和方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2. 方法
            2.1 骨髓單核細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            2.2 OC的誘導(dǎo)
            2.3 TRAP染色及計(jì)數(shù)
            2.4 蛋白樣品提取
            2.5 Western blot方法
            2.6 數(shù)據(jù)分析
        3. 結(jié)果
            3.1 TRAP染色觀察抑制Ca²⁺/CaM/CaMKs信號通路對鎘影響OC分化的作用
            3.2 Western blot檢測鎘影響OC分化中Ca²⁺/CaM/CaMKs信號通路關(guān)鍵蛋的表達(dá)
            3.3 Western blot檢測Ca²⁺/CaM/CaMK信號通路在鎘影響OC分化中的作用
        4. 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3815819