發(fā)布時間：2023-05-07 15:34

　　豬是流感病毒發(fā)生重配的“混合器”以及產生流感病毒新毒株的“孵育器”,因而豬在流感病毒種間傳播中扮演重要角色,因此防止流感病毒在豬群中的傳播具有很重要的公共衛(wèi)生意義。天然免疫系統(tǒng)是機體抵御外界病原感染的非特異性防御系統(tǒng),宿主是否發(fā)病取決于病原感染和機體防御相互作用的結果,防御能力較強的豬便表現(xiàn)出天然的抗病力。因此,從遺傳本質上提高豬對豬流感等病毒的抗病能力,篩選和培育具有抗流感病毒的動物品系,是防控流感病毒的治本之策。而獲得有效的抗病候選基因是開展抗病育種工作的重中之重。同時,流感病毒為了有效的感染宿主會采取各種策略拮抗宿主的抗病毒防御應答,尤其是干擾素介導的天然免疫應答。熱休克蛋白27(HSP27)是一種細胞內廣泛表達的小熱休克蛋白。病毒感染宿主細胞幾乎都會誘導HSP27的高度表達,但是其在病毒感染中的作用仍不清楚。同時,有研究表明,HSP27能夠參與調節(jié)細胞信號轉導通路,包括NF-κB介導的炎癥應答通路,但其在宿主干擾素信號通路中的功能尚不清楚。因此,本研究首先以豬轉錄組芯片-生物信息學為平臺初步篩選流感病毒感染豬誘導表達的基因,通過過表達和沉默技術檢測這些基因對流感病毒增殖的影響,...

【文章頁數(shù)】：124 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第1章 文獻綜述
    1 豬流感
        1.1 北美豬流感病毒
        1.2 歐亞豬流感病毒
        1.3 甲型H1N1豬流感病毒
        1.4 豬與禽流感病毒
    2 高通量篩選病毒感染相關宿主基因技術
        2.1 蛋白互作技術
        2.2 基因組學
        2.3 蛋白質組學
        2.4 RNAi
    3 天然免疫系統(tǒng)
        3.1 模式識別受體
        3.2 TLRs
        3.3 RLRs
        3.4 干擾素
        3.5 JAK-STAT通路
        3.6 干擾素誘導基因
    4 流感病毒誘導的信號通路
    5 干擾素負調控機制
        5.1 降解主要的接頭分子
        5.2 對接頭分子進行蛋白修飾
        5.3 阻斷接頭分子的互作
        5.4 流感病毒拮抗干擾素通路的策略
            5.4.1 通過病毒蛋白拮抗干擾素
            5.4.2 通過宿主蛋白拮抗干擾素
    6 熱休克蛋白
        6.1 HSP60
        6.2 HSP70
        6.3 HSP90
        6.4 sHSPs
    7 HSP27功能介紹
        7.1 HSP27抗凋亡功能
        7.2 HSP27與免疫應答
        7.3 HSP27與病毒感染
第2章 目的與意義
第3章 材料與方法
    1 材料
        1.1 細菌、細胞和病毒
        1.2 質粒
            1.2.1 真核表達質粒
            1.2.2 啟動子相關質粒
            1.2.3 克隆質粒
            1.2.4 RNAi質粒
            1.2.5 細胞定位質粒
            1.2.6 泛素化相關質粒
        1.3 抗體
        1.4 siRNA
        1.5 主要試劑
        1.6 重要儀器和設備
    2 主要方法
        2.1 DNA實驗
            2.1.1 基因克隆
            2.1.2 DNA回收和質粒抽提
            2.1.3 基因組DNA提取
            2.1.4 基因突變技術
        2.2 RNA實驗
            2.2.1 TRIzol法抽提細胞總RNA
            2.2.2 RT-PCR
            2.2.3 熒光定量PCR
        2.3 蛋白實驗
            2.3.1 細胞蛋白抽提及濃度測定
            2.3.2 熒光素酶活性檢測實驗
            2.3.3 免疫共沉淀實驗步驟
            2.3.4 蛋白的泛素化檢測實驗
            2.3.5 SDS-PAGE電泳
            2.3.6 蛋白質轉膜
            2.3.7 Western Blot實驗
            2.3.8 GTP酶活性測定實驗
            2.3.9 流感病毒聚合酶活性測定實驗
        2.4 細胞實驗
            2.4.1 質粒轉染實驗
            2.4.2 siRNA轉染實驗
            2.4.3 間接免疫熒光
            2.4.4 蛋白亞細胞定位觀察
            2.4.5 TCID50的測定
            2.4.6 空斑法檢測病毒含量
        2.5 肺組織病理切片制作
        2.6 統(tǒng)計學處理
第4章 結果與討論
    1 抗流感病毒基因的篩選與功能驗證
        1.1 豬H1N1流感病毒感染模型建立
            1.1.1 臨床癥狀
            1.1.2 病理變化
        1.2 豬H1N1流感病毒感染肺組織芯片
            1.2.1 肺組織RNA樣品檢測
            1.2.2 芯片分析
                1.2.2.1 聚類分析
                1.2.2.2 GO分析
                1.2.2.3 主要的差異表達基因
                1.2.2.4 差異基因Pathway分析
            1.2.3 芯片結果RT-PCR驗證
            1.2.4 RT-PCR檢測豬肺組織ISGs表達變化
        1.3 肺組織差異基因抗病毒功能
            1.3.1 干擾素誘導基因對H1N1病毒增殖的影響
            1.3.2 干擾素誘導基因對H5N1病毒增殖的影響
            1.3.3 豬宿主防御肽對H5N1病毒增殖影響
            1.3.4 豬干擾素啟動子活性檢測
            1.3.5 干擾素誘導基因過表達對干擾素啟動子影響
        1.4 IRF1抗病毒機制研究
            1.4.1 IRF1過表達對H5N1病毒復制的影響
            1.4.2 IRF1過表達對VSV復制的影響
            1.4.3 IRF1過表達對干擾素信號通路影響
        1.5 GBP1抗病毒機制研究
            1.5.1 GBP1過表達對流感病毒增殖的影響
                1.5.1.1 GBP1抑制各種亞型豬流感病毒的復制
                1.5.1.2 GBP1對H5N1流感病毒不同形式RNA的影響
            1.5.2 敲除GBP1對流感病毒增殖的影響
            1.5.3 GTP結合位點與抗病毒有關
                1.5.3.1 GBP1抗病毒結構域確定
                1.5.3.2 GTP結合位點突變后對病毒增殖影響
                1.5.3.3 GBP1的GTPase酶活性測定
            1.5.4 GBP1對干擾素信號通路通路的影響
            1.5.5 GBP1抑制流感病毒聚合酶活力
            1.5.6 GBP1與NP蛋白互作
            1.5.7 GBP1與NP在細胞核周圍共定位
        1.6 討論
        1.7 小結
    2 HSP27拮抗宿主干擾素信號通路研究
        2.1 H5N1感染人的A549細胞后總蛋白表達變化
        2.2 H5N1感染人的A549細胞后HSP27蛋白表達變化
        2.3 其他RNA病毒感染細胞后HSP27變化
        2.4 HSP27定點突變與表達
        2.5 HSP27過表達對H5N1增殖影響
        2.6 HSP27過表達對VSV病毒增殖的影響
        2.7 HSP27沉默對VSV增殖的影響
        2.8 HSP27過表達對干擾素等啟動子影響
        2.9 HSP27過表達抑制VISA和TRIF介導的抗病毒作用以及IRF3磷酸化
        2.10 HSP27沉默對干擾素等啟動子影響
        2.11 HSP27與IFN-β通路接頭分子互作
        2.12 HSP27對VISA、TRAF3和TRAF6表達影響
        2.13 HSP27影響接頭分子泛素化
        2.14 HSP27通過K48泛素化方式降解TRAF3和TRAF6
        2.15 HSP27不改變TRAF3和TRAF6的K63泛素化
        2.16 HSP27定位于線粒體
        2.17 HSP27磷酸化抑制劑對VSV-GFP病毒增殖影響
        2.18 HSP27磷酸化對干擾素啟動子活性以及H5N1病毒CPE影響
        2.19 HSP27磷酸化位點突變體與VISA互作研究
        2.20 討論
        2.21 小結
第5章 總結
參考文獻
個人簡歷
發(fā)表的主要論文
致謝



本文編號：3810844