為提高病毒的分離效率,本試驗設(shè)計構(gòu)建了能夠表達犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)上皮細胞Nectin4受體的Vero細胞。為增加蛋白定位的準確性并易于鑒定,使用Igκ信號肽替換原有信號肽序列并添加了HA標簽,在Nectin4 ORF后串聯(lián)IRES-Puro序列并連入pCI-Neo真核表達載體,得到完整的轉(zhuǎn)染載體pCI-N4。不同濃度嘌呤霉素孵育Vero細胞得到最小篩選濃度為6μg/mL。pCI-N4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細胞后使用6μg/mL嘌呤霉素篩選,5～7 d后出現(xiàn)具有抗性的細胞簇,有限稀釋法連續(xù)單克隆純化3代后獲得穩(wěn)定表達的細胞系。構(gòu)建細胞系傳代至15代能檢測到Nectin4 mRNA轉(zhuǎn)錄,Western blotting檢測篩選細胞得到約60 ku目的蛋白表達,間接免疫熒光檢測顯示純化細胞蛋白表達豐度高且表達均一,激光共聚焦觀察Nectin4目的蛋白定位于細胞膜,說明篩選的Vero-Nectin4細胞系能夠穩(wěn)定表達,表達蛋白能夠滿足作為CDV受體的結(jié)構(gòu)要求。臨床CDV陽性病料經(jīng)研磨濾菌處理后接種構(gòu)建細胞系能夠產(chǎn)生典型的合胞體細胞病變,Vero對照...

【文章頁數(shù)】：9 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 主要試劑
    1.3 引物及表達載體構(gòu)建
    1.4 Vero細胞穩(wěn)定細胞系篩選
        1.4.1 Vero細胞嘌呤霉素敏感度測定
        1.4.2 Vero細胞轉(zhuǎn)染及陽性單克隆細胞篩選
        1.4.3 單克隆細胞系鑒定
        1.4.4 Western blotting鑒定目的蛋白表達
        1.4.5 間接免疫熒光方法測定Nectin4受體蛋白的表達
    1.5 CDV分離與鑒定
2 結(jié) 果
    2.1 表達載體構(gòu)建
    2.2 Vero細胞穩(wěn)定細胞系篩選
    2.3 篩選細胞CDV分離鑒定
3 討 論
4 結(jié) 論



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