目的：ω-3PUFAs對于維持生命有機體的正常發(fā)育和生長，防治各種疾病都有至關(guān)重要的作用，由于缺乏能夠?qū)ⅵ?6PUFAs轉(zhuǎn)化成ω-3PUFAs的脫氫酶基因，人體內(nèi)的ω-6/ω-3PUFAs達不到1:1理想的平衡，所以每天必須攝入一定量的ω-3PUFAs，來保證有機體正常的功能和自身穩(wěn)定。目前富含ω-3PUFAs食物主要是深海魚類，來源范圍很窄，導(dǎo)致人體內(nèi)ω-6PUFAs過多而ω-3PUFAs嚴重不足，對嬰幼兒智力發(fā)育、心腦血管疾病和癌癥的預(yù)防起不了積極作用。因此從家畜繁殖與育種的角度出發(fā)，制備能夠表達ω-3PUFAs的脫氫酶基因Fat-1的新品種綿羊，從而培育出富含ω-3PUFAs高品質(zhì)羊肉。 方法：1.Fat-1表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因細胞系建立 采用組織塊附植法分離得到了18月齡薩福克公羊成纖維細胞系；通過PCR擴增得到了人泛素啟動子UbB序列，對秀麗隱桿線蟲Fat-1基因密碼子根據(jù)綿羊?qū)νx密碼子使用偏好性進行優(yōu)化，然后由公司合成獲得oFat-1基因序列；雙酶切法從pcDNA3.1中獲得GBHpolyA序列，將上述3段序列共同插入pCMV-DsRed2-1載體的多克隆位點（MCS），...

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮寫對照
文獻綜述
    1 Fat - 1 基因
        1.1 Fat -1 基因來源及結(jié)構(gòu)
        1.2 Fat -1 基因研究現(xiàn)狀
    2 不飽和脂肪酸脫氫酶的研究進展
    3 多不飽和脂肪酸
        3.1 多不和脂肪酸概述
        3.2 多不飽和脂肪酸研究進展
        3.3 ω- 3PUFAs 的生理作用
            3.3.1 臨床作用
            3.3.2 對血管疾病作用
            3.3.3 ω- 3PUFAs 與抗癌作用
        3.4 ω- 3PUFAs 的測定方法研究進展
    4 泛素啟動子研究
        4.1 泛素啟動子的結(jié)構(gòu)
        4.2 泛素啟動子的作用機制
        4.3 泛素啟動子的研究現(xiàn)狀
    5 本課題研究的目的和意義
試驗研究
    試驗1 薩福克羊成纖維細胞體外培養(yǎng)
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 試驗材料
                1.1.1 細胞來源
                1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)液
                1.1.3 主要儀器設(shè)備
            1.2 試驗方法
                1.2.1 薩�？搜虺衫w維細胞原代培養(yǎng)
                1.2.2 細胞分離培養(yǎng)及傳代
                1.2.3 細胞的凍存
                1.2.4 細胞的復(fù)蘇
                1.2.5 細胞對 G418 敏感度檢測
        2 試驗結(jié)果與分析
            2.1 成纖維細胞體外生長狀況及特征觀察
            2.3 G418 敏感度檢測
        3 討論
        4 小結(jié)
    試驗2 UbB 啟動子的功能驗證
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 試驗材料
                1.1.1 細胞來源
                1.1.2 質(zhì)粒的和感受態(tài)細胞
                1.1.3 主要試驗試劑和溶液配制
                1.1.4 主要試驗儀器
            1.2 試驗方法
                1.2.1 引物設(shè)計
                1.2.2 啟動子 UbB 的克隆
                    1.2.2.1 UbB 序列的 PCR 擴增
                    1.2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測
                    1.2.2.3 PC R 產(chǎn)物回收及連接 T-easy Vector
                    1.2.2.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH - 5α
                    1.2.2.5 陽性克隆的篩選和初步鑒定
                1.2.3 UbB - pEGFP- c1 表達載體構(gòu)建
                    1.2.3.1 重組質(zhì)粒提取
                    1.2.3.2 雙酶切、回收純化及連接
                1.2.4 轉(zhuǎn)染細胞和比較啟動效率
        2 試驗結(jié)果
            2.1 啟動子 PCR 擴增
            2.2 重組質(zhì)粒 UbB- pEGFP - c1 酶切鑒定
            2.3 轉(zhuǎn)染細胞和比較啟動效率
        3 討論
        4 小結(jié)
    試驗3 含 Fat - 1 基因表達載體的構(gòu)建
        摘要
        1 試驗材料與方法
            1.1 試驗材料
                1.1.1 質(zhì)粒和宿主菌
                1.1.2 主要試劑、溶液和儀器設(shè)備
            1.2 試驗方法
                1.2.1 Fat - 1 基因密碼子優(yōu)化
                1.2.2 表達載體構(gòu)建
                1.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定
                    1.2.3.1 PCR 擴增鑒定
                    1.2.3.2 酶切鑒定
                    1.2.3.3 測序鑒定
        2 試驗結(jié)果
            2.1 密碼子使用頻率分析
            2.2 重組質(zhì)粒合成與鑒定
            2.3 重組表達載體分子水平鑒定
            2.4 測序鑒定
        3 討論
        4 小結(jié)
    試驗4 Fat -1 基因在綿羊成纖維細胞中的表達
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 細胞來源
                1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)液
                1.1.3 主要儀器設(shè)備
            1.2 方法
                1.2.1 細胞準備
                1.2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
                1.2.3 細胞篩選
                1.2.4 純化培養(yǎng)
                1.2.5 陽性細胞 DNA 水平鑒定
                1.2.6 陽性細胞 RNA 水平鑒定
                    1.2.6.1 陽性細胞 RNA 提取
                    1.2.6.2 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA (Reverse Transcription ，RT )
                    1.2.6.3 RT - PCR 擴增
                1.2.7 脂肪酸含量測定
                1.2.8 細胞染色體數(shù)目分析
        2 試驗結(jié)果
            2.1 綿羊成纖維細胞的轉(zhuǎn)染和篩選
            2.2 轉(zhuǎn)基因細胞的鑒定
            2.3 脂肪酸含量變化檢測
            2.4 染色體數(shù)目形態(tài)分析
        3 討論
        4 小結(jié)
    試驗5 轉(zhuǎn) Fat - 1 基因克隆綿羊的制備
        摘要
        1 試驗材料與方法
            1.1 試驗材料
                1.1.1 供體與受體來源
                1.1.2 試驗試劑和藥品
                1.1.3 試驗儀器
            1.2 試驗方法
                1.2.1 綿羊卵母細胞采集與體外成熟
                1.2.2 受體細胞的處理
                1.2.3 供體細胞的準備
                1.2.4 重構(gòu)胚的制備
                    1.2.4.1 去核
                    1.2.4.2 移核
                    1.2.4.3 融合
                    1.2.4.4 融合胚的激活與發(fā)育培養(yǎng)
                    1.2.4.5 胚胎移植
                1.2.6 B 超檢查、產(chǎn)羔及接產(chǎn)
                1.2.7 轉(zhuǎn) oFat-1 基因克隆羊初步 PCR 鑒定
                1.2.8 轉(zhuǎn)基因綿羊成纖維細胞染色體數(shù)目分析
        2 試驗結(jié)果
            2.1 成熟卵母細胞的收獲
            2.2 核移植制備重構(gòu)胚
            2.3 胚胎移植、B 超妊娠確診與產(chǎn)羔
            2.4 克隆羊 PCR 初步鑒定
            2.5 染色體數(shù)目分析
        3 討論
        4 小結(jié)
全文結(jié)論及創(chuàng)新
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介



本文編號：3794156