發(fā)布時(shí)間：2023-04-19 03:25

　　【目的】利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞(GFFs)中硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)基因,旨在為奶山羊敲入外源性基因奠定理論基礎(chǔ)以及構(gòu)建動(dòng)物模型提供生物材料.【方法】根據(jù)"20N+NGG"原則在SCD1第4外顯子和第6外顯子分別設(shè)計(jì)6個(gè)靶向SCD1基因sgRNA(F1、F2、F3、S1、S2、S3),構(gòu)建PX330-eGFP-sgRNA敲除載體,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到GFFs中,PCR擴(kuò)增陽(yáng)性細(xì)胞SCD1外顯子4和外顯子6的核苷酸序列,連接到pEASY-Blunt載體上,測(cè)序評(píng)估不同sgRNA的敲除效率;分別在第4外顯子和第6外顯子選擇敲除效率高的sgRNA共同轉(zhuǎn)染GFFs,經(jīng)流式分選獲得敲除SCD1基因的GFFs.【結(jié)果】設(shè)計(jì)的6個(gè)sgRNA均能夠連入PX330-eGFP載體中,單克隆菌測(cè)序試驗(yàn)表明sgRNA F2、sgRNA F3、sgRNA S1和sgRNA S2具有敲除作用,其敲除效率分別為41.67%、30.77%、6.67%和28.57%;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明sgRNA-F2-S2與sgRNA-F3-S2轉(zhuǎn)染組均能顯著降低陽(yáng)性細(xì)胞中SC...

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 試驗(yàn)材料
    1.2 試驗(yàn)方法
        1.2.1 引物設(shè)計(jì)
        1.2.2 sgRNA的合成及程序性退火
        1.2.3 敲除載體的構(gòu)建
        1.2.4 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及切割效率的檢測(cè)
        1.2.5 PX330-eGFP-sgRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞
        1.2.6 Quantitative RT-PCR檢測(cè)
        1.2.7 Western Blot檢測(cè)
2 結(jié)果與分析
    2.1 敲除載體的構(gòu)建
    2.2 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果
    2.3 分選陽(yáng)性細(xì)胞及其PCR檢測(cè)
    2.4 不同靶位點(diǎn)sgRNA敲除效率的篩選
    2.5 敲除SCD1基因GFFs的制備
3 討論
4 結(jié)論



本文編號(hào)：3793622