偽狂犬病(Pesudorabies virus.PRV)又稱奇癢癥,是由偽狂犬病毒引起的多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢(豬除外)、腦脊髓炎和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主要特征的高度接觸性傳染病。豬是其天然宿主、儲存宿主和傳染源,可垂直傳播,也可通過消化道、相互接觸而傳播。目前在全世界廣泛流行,給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2011年前后,我國多地區(qū)接種過Bartha K61基因缺失疫苗的豬場暴發(fā)了疑似PR疫情,造成新生仔豬死亡率高,母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等,給各地養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)從四川某接種過疫苗后,出現(xiàn)大規(guī)模新生仔豬死亡疑似PR感染的豬場仔豬腦組織樣品中成功分離到一株P(guān)RV野毒株,將其命名為PRV-XJ株。將其接種于BHK-21細(xì)胞,30h后細(xì)胞出現(xiàn)聚集、收縮、變圓、拉網(wǎng)、折光性增強(qiáng)、成片脫落等典型的細(xì)胞病變,將其進(jìn)行5輪蝕斑純化后,進(jìn)行了一系列的生物學(xué)鑒定和部分生物學(xué)特性分析。分離到的PRV-XJ株在BHK-21細(xì)胞上生長滴度可達(dá)10^7.67TCID₅₀/mL,能被PRV陽性血清中和,其中和效價為1：128,將其接種小鼠,很快小鼠出現(xiàn)...

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要縮略詞
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 病原學(xué)
        1.1 PRV的結(jié)構(gòu)特征
        1.2 PRV的理化特性和培養(yǎng)特性
        1.3 PRV分子生物學(xué)特性
            1.3.1 PRV基因結(jié)構(gòu)
            1.3.2 非必需糖蛋白及功能
            1.3.3 必需糖蛋白及功能
        1.4 PRV的復(fù)制
        1.5 PRV的致病機(jī)制
    2 PRV的流行及診斷
        2.1 PRV在全球范圍的流行
        2.2 PRV在我國的流行
        2.3 臨床癥狀及病理變化
        2.4 PRV的檢測
            2.4.1 病毒的分離
            2.4.2 血清學(xué)診斷
    3 疫苗防治
        3.1 弱毒疫苗
        3.2 滅活苗
        3.3 DNA疫苗
        3.4 重組疫苗
        3.5 亞單位疫苗
        3.6 基因缺失苗
            3.6.1 單基因缺失苗
            3.6.2 雙基因缺失苗
            3.6.3 多基因缺失苗
        3.7 gE/gI基因缺失在疫苗防治的應(yīng)用前景
    4 研究目的及意義
第二章 PRV野毒株的分離鑒定及部分生物學(xué)特性分析
    1 材料
        1.1 病料
        1.2 細(xì)胞、主要試劑
        1.3 陽性血清和試驗(yàn)小鼠
        1.4 主要培養(yǎng)基及其配制
        1.5 主要儀器
    2 方法
        2.1 用于檢測的PCR引物
        2.2 病毒核酸提取及PCR鑒定
        2.3 病毒的分離
        2.4 病毒的蝕斑純化
        2.5 外源病毒的檢測
        2.6 病毒TCID₅₀的測定
        2.7 病毒的血清中和試驗(yàn)
        2.8 小鼠LD₅₀的測定
        2.9 PRV部分基因的分段擴(kuò)增及序列分析
            2.9.1 用于擴(kuò)增PRV XJ株部分基因片段的引物設(shè)計(jì)
            2.9.2 PRV XJ株DNA的分段擴(kuò)增
            2.9.3 克隆片段的膠回收
            2.9.4 回收片段的連接轉(zhuǎn)化
            2.9.5 重組質(zhì)粒的鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)
            2.9.6 擴(kuò)增目的片段的基因測序與序列拼接
            2.9.7 PRV-XJ株部分基因組的序列分析
    3 結(jié)果
        3.1 病料檢測
        3.2 PRV病毒的分離
        3.3 病毒的空斑形態(tài)
        3.4 外源病毒的檢測結(jié)果
        3.5 PRV-XJ株TCID₅₀的測定
        3.6 PRV-XJ株的中和試驗(yàn)
        3.7 小鼠感染試驗(yàn)
        3.8 PRV-XJ株gE、gC、gD及gB基因擴(kuò)增結(jié)果
        3.9 陽性質(zhì)粒的鑒定
        3.10 PRV-XJ株gE基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.10.1 gE基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.10.2 gE基因氨基酸進(jìn)化樹分析
        3.11 PRV-XJ株gC基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.11.1 gC基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.11.2 gC基因氨基酸進(jìn)化樹分析
        3.12 PRV-XJ株gD基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.12.1 gD基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.12.2 gD基因氨基酸進(jìn)化樹分析
        3.13 PRV-XJ株gB基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.13.1 gB基因核苷酸和氨基酸序列分析
            3.13.2 gB基因氨基酸進(jìn)化樹分析
    4 討論
        4.1 分離鑒定
        4.2 序列分析
    5 小結(jié)
第三章 PRV-gI/gE雙基因缺失突變株的構(gòu)建和免疫效力研究
    1 材料
        1.1 細(xì)胞、病毒、質(zhì)粒和試劑
        1.2 實(shí)驗(yàn)動物
        1.3 主要儀器
    2 方法
        2.1 質(zhì)粒DNA的小量制備及酶切鑒定
        2.2 質(zhì)粒的大量制備
        2.3 PRV-XJ株病毒DNA的提取
        2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的準(zhǔn)備
        2.5 體外轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法(LiPofection Reagent)
        2.6 基因缺失病毒rPRVXJ-de1gI/gE-EGFP的純化
        2.7 基因缺失病毒rPRVXJ-de1gI/gE-EGFP的PCR鑒定與IFA
        2.8 基因缺失病毒rPRVXJ-de1gI/gE-EGFP的一步生長曲線測定
        2.9 免疫及攻毒
        2.10 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)
        2.11 免疫及攻毒后的排毒檢測
        2.12 數(shù)據(jù)處理
    3 結(jié)果
        3.1 質(zhì)粒pPI-2.EGFP的鑒定
        3.2 PRV的同源重組和rPRVXJ-de1gI/gE-EGFP的純化
        3.3 基因缺失病毒rPRVXJ-de1gI/gE-EGFP的鑒定
        3.4 病毒生長曲線的測定
        3.5 中和抗體水平檢測
        3.6 免疫及攻毒后臨床變化
        3.7 免疫及攻毒后排毒檢測
    4 討論
    5 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3793441