2006年,誘導多能干細胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)被日本東京大學的Takahashi和Yamanaka發(fā)現(xiàn),由于其與胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells, ES)存在相似的自我更新和分化潛能,且不涉及倫理問題。因此,在臨床治療等方面具有廣闊的研究前景并迅速成為當前研究的熱點。 本試驗以山羊為材料分離山羊耳尖成纖維細胞(Goat ear fibroblast, GEF),并通過多順反子慢病毒系統(tǒng)和可誘導慢病毒系統(tǒng)嘗試重編程GEF為山羊iPS細胞,優(yōu)化山羊iPS細胞的誘導方法。結果如下： 1.通過組織塊貼壁法成功分離得到GEF,通過酶消化法分離C57/BL6小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse Embryonic Fibroblast, MEF)。絲裂霉素C處理MEF和GEF,制備飼養(yǎng)層。 2.慢病毒載體與包裝載體共轉293t細胞,進行慢病毒包裝,48h后,熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達,收集慢病毒上清液并測定滴度。多順反子慢病毒plentG-KOSM滴度為105～6TU/ml,用Millipore的100KD濃縮柱使其滴度達到...

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 iPS細胞系的制備方法
        1.1 轉錄因子的選擇
            1.1.1 Oct4
            1.1.2 Sox2
            1.1.3 Klf4
            1.1.4 c-Myc
            1.1.5 Lin28
            1.1.6 Nanog
            1.1.7 hTert
            1.1.8 SV40大T抗原
        1.2 基因導入方式
        1.3 靶細胞的選擇
        1.4 iPS細胞的培養(yǎng)條件
        1.5 iPS克隆的識別和鑒定
    2 iPS細胞的臨床應用前景
    3 研究的目的和意義
第二章 材料與方法
    1 試驗材料
        1.1 試驗動物
        1.2 載體和菌株
        1.3 試劑及其配置
            1.3.1 主要試劑
            1.3.2 溶液的配制
        1.4 主要儀器和設備
    2 試驗方法
        2.1 質粒獲取
            2.1.1 質�；厥�
            2.1.2 質粒轉化
            2.1.3 質粒提取
            2.1.4 質粒雙酶切鑒定
        2.2 細胞分離培養(yǎng)
            2.2.1 MEF分離培養(yǎng)
            2.2.2 GEF分離培養(yǎng)
        2.3 慢病毒包裝
            2.3.1 準備包裝細胞
            2.3.2 轉染
            2.3.3 收集病毒
        2.4 病毒滴度測定
        2.5 飼養(yǎng)層細胞制備
        2.6 山羊iPS細胞的建立
            2.6.1 慢病毒感染GEF
            2.6.2 iPS克隆挑選
            2.6.3 iPS克隆的傳代擴增
            2.6.4 山羊iPS細胞凍存
            2.6.5 山羊iPS細胞復蘇
        2.7 山羊iPS細胞生物學特性檢測
            2.7.1 形態(tài)學鑒定
            2.7.2 堿性磷酸酶染色
            2.7.3 細胞內ES細胞標志性基因表達的檢測
            2.7.4 免疫熒光染色
            2.7.5 山羊iPS表觀遺傳特征分析
            2.7.6 體外分化能力檢測
            2.7.7 畸胎瘤形成與體內分化能力測定
第三章 結果與分析
    1 慢病毒載體鑒定
        1.1 質粒提取
        1.2 酶切鑒定
    2 GEF和MEF分離培養(yǎng)及飼養(yǎng)層的制作
        2.1 GEF分離培養(yǎng)
        2.2 MEF分離培養(yǎng)
    3 慢病毒包裝
        3.1 plentG-KOSM
        3.2 可誘導慢病毒系統(tǒng)
    4 山羊iPS細胞的獲得
        4.1 plentG-KOSM
        4.2 可誘導慢病毒系統(tǒng)
    5 AP染色
    6 ES細胞標志性基因表達的檢測
    7 免疫熒光染色
    8 表觀遺傳狀態(tài)鑒定
    9 體外分化
    10 畸胎瘤實驗
第四章 討論
    1 慢病毒載體的選擇
    2 GEF和MEF的分離培養(yǎng)
    3 慢病毒包裝
    4 山羊iPS細胞的獲得
    5 ES細胞標志性物
    6 表觀遺傳狀態(tài)鑒定
    7 體內外分化能力
第五章 小結
在讀期間發(fā)表論文
參考文獻
致謝



本文編號：3785965