內(nèi)蒙古阿爾巴斯白絨山羊是我國一種獨(dú)特的生物資源,經(jīng)過長期的自然選擇和人工選育成為目前世界上產(chǎn)絨量最高、絨纖維品質(zhì)最好的品種之一。提高絨山羊產(chǎn)絨量,培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的絨山羊新品種是絨山羊育種工作目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)室已獲得轉(zhuǎn)VEGF基因的絨山羊且產(chǎn)絨量明顯提高,顯示出良好的育種前景。近些年,通過基因組編輯技術(shù)可以快速改變特定性狀基因組成,獲得所需優(yōu)良品種。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù),選用高表達(dá)位點(diǎn)CCR5,構(gòu)建CCR5基因gRNA載體和VEGF基因定點(diǎn)敲入載體,利用電轉(zhuǎn)染法將載體轉(zhuǎn)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中,篩選出VEGF基因在CCR5位點(diǎn)定點(diǎn)敲入的陽性細(xì)胞。將該細(xì)胞作為核供體細(xì)胞,應(yīng)用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)出VEGF基因定點(diǎn)整合絨山羊,以便為培育產(chǎn)絨量高、絨纖維品質(zhì)好的絨山羊新品種提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.載體構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了4對基于CCR5基因二號外顯子的gRNA表達(dá)載體,通過SURVEYOR酶切突變檢測到CCR5-gRNA4發(fā)生突變,其他三對沒有檢測到突變,確定gRNA表達(dá)載體為CCR5-gRNA4。同時成功構(gòu)建了在CCR5位點(diǎn)定點(diǎn)整合VEGF基因敲入的載體P1-KV-polyA...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述 CRISPR/Cas 系統(tǒng)概述
    一、CRISPR/CAS系統(tǒng)的歷史
    二、CRISPR/CAS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
    三、CRISPR/CAS系統(tǒng)的類型
    四、CRISPR/CAS系統(tǒng)的免疫作用機(jī)制
    五、CRISPR/CAS9系統(tǒng)的特點(diǎn)
    六、CRISPR/CAS9技術(shù)的應(yīng)用
    七、CRISPR/CAS9技術(shù)目前存在的問題
    八、CRISPR/CAS9技術(shù)的展望
第二章 CRISPR/CAS9技術(shù)介導(dǎo)絨山羊VEGF基因定點(diǎn)整合的研究
    1 引言
        1.1 CRISPR/CAS9介導(dǎo)VEGF基因在CCR5位點(diǎn)定點(diǎn)敲入載體的構(gòu)建
        1.2 CRISPR/CAS9介導(dǎo)VEGF基因打靶細(xì)胞系的篩選及鑒定
        1.3 定點(diǎn)敲入VEGF基因的絨山羊制備與檢測
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 主要儀器設(shè)備
            2.1.2 主要試劑及耗材
            2.1.3 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染條件的確定
            2.2.2 VEGF外源基因整合載體P1-KV-polyA-P2的構(gòu)建
            2.2.3 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞分離及培養(yǎng)
            2.2.4 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的解凍及復(fù)蘇
            2.2.5 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的性別鑒定
            2.2.6 VEGF打靶載體P1-KV-polyA-P2轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞
            2.2.7 VEGF基因定點(diǎn)敲入陽性細(xì)胞的篩選
            2.2.8 VEGF基因打靶陽性細(xì)胞的鑒定
            2.2.9 體細(xì)胞核移植技術(shù)制備重構(gòu)胚胎
            2.2.10 原核注射技術(shù)制備克隆胚胎
            2.2.11 移植及產(chǎn)羔
            2.2.12 定點(diǎn)整合VEGF基因絨山羊的鑒定
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染條件的確定
        3.2 gRNA表達(dá)載體設(shè)計(jì)和構(gòu)建
            3.2.1 gRNA的設(shè)計(jì)
            3.2.2 gRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2.3 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的質(zhì)量檢測
            3.2.4 Surveyor突變檢測試劑盒檢測結(jié)果
        3.3 VEGF外源基因敲入載體P1-KV-polyA-P2
            3.3.1 上游同源臂(P1)下游同源臂(P2)及polyA序列的克隆
            3.3.2 打靶載體P1-KV-polyA-P2的構(gòu)建
            3.3.3 打靶載體P1-KV-polyA-P2鑒定
        3.4 阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
        3.5 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的性別鑒定
        3.6 VEGF打靶載體P1-KV-polyA-P2轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞
        3.7 VEGF基因打靶陽性細(xì)胞的鑒定
        3.8 卵母細(xì)胞體外成熟及發(fā)育
        3.9 重構(gòu)胚胎移植及產(chǎn)羔
        3.10 定點(diǎn)整合VEGF基因絨山羊的鑒定
            3.10.1 新生羊PCR擴(kuò)增檢測
            3.10.2 新生絨山羊皮膚組織中VEGF基因的mRNA表達(dá)情況
            3.10.3 新生絨山羊皮膚組織中VEGF基因蛋白水平表達(dá)情況
    4 討論
        4.1 CRISPR/CAS9介導(dǎo)VEGF基因在CCR5位點(diǎn)定點(diǎn)敲入載體的構(gòu)建
        4.2 CRISPR/CAS9介導(dǎo)VEGF基因打靶細(xì)胞系的篩選及鑒定
        4.3 定點(diǎn)敲入VEGF基因的絨山羊制備與檢測
參考文獻(xiàn)
結(jié)論
致謝
攻讀學(xué)位期間已發(fā)表學(xué)術(shù)論文



本文編號：3779995