H5N1亞型高致病性禽流感不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的危害,而且威脅人類健康與公共衛(wèi)生安全。滅活疫苗免疫是目前防控禽流感的有效措施之一,但滅活苗候選株的篩選耗時(shí)費(fèi)力,且疫苗生產(chǎn)過程涉及活病毒,存在生物安全隱患,并受雞胚供應(yīng)的限制。禽流感血凝素(Hemagglutinin, HA)亞單位疫苗可以避免滅活苗的缺點(diǎn),HA蛋白是禽流感病毒主要表面抗原,具有刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的作用,是研發(fā)亞單位疫苗的主要靶標(biāo)蛋白。其他研究表明桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的HA+M1蛋白,其生物學(xué)活性、抗原性和免疫原性方面與天然HA蛋白極為相似,但是目前關(guān)于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HA蛋白,其生物學(xué)活性、抗原性和免疫原性方面報(bào)道相對(duì)較少。因此,本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)H5亞型禽流感HA蛋白,并對(duì)該重組蛋白的血凝活性、VLP (Virus-like particle, VLP)組裝、免疫原性等進(jìn)行研究。構(gòu)建含HA基因的克隆載體。兩種途徑獲得HA基因。用RT-PCR方法從禽流感(H5亞型,Re-6株)檢測(cè)抗原中擴(kuò)增HA基因,命名為L(zhǎng)。另根據(jù)GenBank中HA基因進(jìn)行比對(duì)分析,選取HA基因序列,命名為H。再根據(jù)昆蟲細(xì)胞的密碼...

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要英文縮寫
文獻(xiàn)綜述
引言
1 材料與方法
    1.1 菌株與質(zhì)粒等
    1.2 主要試劑(盒)
    1.3 溶液與培養(yǎng)基
        1.3.1 抗生素母液
        1.3.2 X-Gal、IPTG、PHA和MTT
        1.3.3 LB培養(yǎng)基
        1.3.4 PBS(PBST)緩沖液
        1.3.5 瓊脂糖凝膠電泳
        1.3.6 Western blot相關(guān)溶液
    1.4 PCR引物設(shè)計(jì)與合成
    1.5 SDS-PAGE相關(guān)試劑
    1.6 主要儀器
    1.7 基因克隆及序列分析
        1.7.1 RNA提取
        1.7.2 反轉(zhuǎn)錄
        1.7.3 目的基因擴(kuò)增
        1.7.4 連接與轉(zhuǎn)化
        1.7.5 重組克隆質(zhì)粒鑒定
        1.7.6 基因序列優(yōu)化與合成
    1.8 H5N1亞型禽流感HA基因重組
        1.8.1 H-NSTHA基因片段克隆
        1.8.2 H-HA基因片段克隆
        1.8.3 L-NSTHA基因片段克隆
        1.8.4 L-HA基因片段克隆
        1.8.5 連接與轉(zhuǎn)化
        1.8.6 重組質(zhì)粒鑒定
    1.9 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.9.1 雙酶切
        1.9.2 連接與轉(zhuǎn)化
        1.9.3 重組質(zhì)粒鑒定
        1.9.4 E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞制備
        1.9.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與篩選
        1.9.6 重組真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定
    1.10 重組桿狀病毒的制備和鑒定
        1.10.1 重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞
        1.10.2 重組P2/P3代桿狀病毒的擴(kuò)增
        1.10.3 重組桿狀病毒鑒定
        1.10.4 重組桿狀病毒滴度測(cè)定
    1.11 重組桿狀病毒表達(dá)蛋白分析
        1.11.1 重組蛋白SDS-PAGE分析
        1.11.2 重組蛋白Western blot分析
        1.11.3 間接免疫熒光(IFA)
        1.11.4 重組蛋白的血凝價(jià)
        1.11.5 電鏡觀察VLP形態(tài)
    1.12 重組蛋白的免疫原性
        1.12.1 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)
        1.12.2 CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化檢測(cè)
        1.12.3 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
2 結(jié)果與分析
    2.1 禽流感HA基因的克隆及序列分析
        2.1.1 HA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
        2.1.2 重組克隆質(zhì)粒的PCR鑒定
        2.1.3 HA基因測(cè)序結(jié)果與序列分析
    2.2 H5亞型禽流感HA基因的重組
        2.2.1 H-NSTHA基因的重組
        2.2.2 L-NSTHA基因的重組
        2.2.3 全基因的PCR片段的擴(kuò)增
        2.2.4 重組克隆質(zhì)粒的酶切鑒定
    2.3 重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.1 重組供體質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定
        2.3.2 重組穿梭載體的構(gòu)建與鑒定
    2.4 重組桿狀病毒的制備與鑒定
        2.4.1 重組桿狀病毒的制備
        2.4.2 重組桿狀病毒的鑒定
        2.4.3 重組桿狀病毒滴度的測(cè)定
    2.5 重組蛋白在昆蟲細(xì)胞上的表達(dá)
        2.5.1 重組蛋白SDS-PAGE鑒定
        2.5.2 重組蛋白Western blot分析
        2.5.3 間接免疫熒光檢測(cè)(IFA)
        2.5.4 重組蛋白的血凝活性的檢測(cè)
        2.5.5 電鏡觀察結(jié)果
    2.6 重組蛋白的免疫原性
        2.6.1 HI檢測(cè)抗體水平
        2.6.2 間接ELISA檢測(cè)抗體
        2.6.3 CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化
        2.6.4 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)
3 討論
    3.1 高致病性禽流感H5N1 HA基因的設(shè)計(jì)
    3.2 H5N1亞型禽流感重組HA蛋白在桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)
    3.3 重組HA蛋白免疫原性
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3769850