發(fā)布時間：2023-02-26 01:53

　　n-3多不飽和脂肪酸為人體必需脂肪酸,可降低多種疾病發(fā)生的鳳險,n-3的不足及n-6/n-3比例失衡,不僅在發(fā)育階段還在整個生命過程中對人體各代謝活動產(chǎn)生不良影響,但是由于人體內(nèi)缺乏相應的酶類導致其合成量較少,必須依賴于食物攝入。線蟲fat-1基因編碼的脂肪酸去飽和酶,可將n-6脂肪酸轉(zhuǎn)化為n-3脂肪酸,調(diào)和機體n-6/n-3比例。因此,fat-1轉(zhuǎn)基因動物將成為人類必需的n-3脂肪酸的重要來源。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動物制備過程中由于目的基因整合位點隨機性,不利于目的基因的表達及調(diào)控,具有安全隱患。本研究將新型的鋅指核酸酶技術(shù)與傳統(tǒng)的同源重組打靶技術(shù)相結(jié)合,實現(xiàn)hsfat-1基因在豬ROSA26位點的定點整合,提高了轉(zhuǎn)基因動物的安全性。具體研究內(nèi)容如下：1、本研究中將線蟲fat-1基因按照哺乳動物密碼子使用偏好性進行優(yōu)化并制備哺乳動物表達載體,通過轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞及G418篩選得到陽性克隆,在陽性克隆細胞培養(yǎng)時添加脂肪酸去飽和酶作用底物花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA),通過GC-MS定細胞中各脂肪酸含量間接評估脂肪酸去飽和酶將n-6脂肪酸轉(zhuǎn)化為n-3脂肪酸能力。結(jié)果表明...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
1 前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 fat-1基因研究進展
    1.3 基因的定點整合研究進展
        1.3.1 整合位點選擇
        1.3.2 目的基因座的定點切割
    1.4 目的基因的表達調(diào)控策略
    1.5 轉(zhuǎn)基因動物制備方法
        1.5.1 DNA顯微注射法
        1.5.2 慢轉(zhuǎn)錄病毒感染法
        1.5.3 精子載體法
        1.5.4 體細胞核移植
        1.5.5 轉(zhuǎn)座子介導的基因轉(zhuǎn)移
        1.5.6 誘導性多能干細胞
    1.6 轉(zhuǎn)基因動物應用
        1.6.1 轉(zhuǎn)基因動物生物反應器
        1.6.2 實驗動物模型
        1.6.3 基因治療
        1.6.4 改造生物、培育新的生物品種
        1.6.5 器官移植
    1.7 本研究的目的意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 主要組織樣品
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器及耗材
        2.1.4 主要分析軟件及數(shù)據(jù)庫
    2.2 方法
        2.2.1 本研究的技術(shù)路線
        2.2.2 hsfat-1基因優(yōu)化合成
        2.2.3 hsfat-1基因功能驗證
        2.2.4 豬ROSA26定點切割鋅指核酸酶(ZFNs)設計
        2.2.5 定點整合載體ROSA26-hsfat-1構(gòu)建及驗證
        2.2.6 細胞篩選及鑒定
        2.2.7 重構(gòu)胚的制備與移植
3 結(jié)果
    3.1 hsfat-1基因優(yōu)化合成
    3.2 hsfat-1基因功能驗證
        3.2.1 pcDNA3.1(+)hsfat-1質(zhì)粒提取及酶切鑒定
        3.2.2 pcDNA3.1(+)hsfat-1、pcDNA3.1(+)載體轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞
        3.2.3 hsfat-1陽性克隆去飽和酶功能驗證
    3.3 豬ROSA26定點切割ZFNs預測結(jié)果
    3.4 定點整合載體ROSA26-hsfat-1構(gòu)建及細胞篩選
        3.4.1 定點整合載體ROSA26-hsfat-1構(gòu)建
        3.4.2 ROSA26-hsfat-1轉(zhuǎn)基因細胞篩選
    3.5 重構(gòu)胚的制備與移植
        3.5.1 重構(gòu)胚的制備
        3.5.2 重構(gòu)胚的移植
4 討論
    4.1 關于hsfat-1基因編碼的脂肪酸去飽和酶的活性
    4.2 關于本研究基因打靶效率的討論
    4.3 單克隆細胞篩選的效率效率的問題
    4.4 關于篩選標記基因的去除
5 小結(jié)
    5.1 本研究結(jié)論
    5.2 本研究創(chuàng)新點與特色
    5.3 本研究不足點與下一步工作建議
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3749571