2011-2012年肉雞和蛋雞腺胃炎發(fā)病率較高，該病在中國(guó)大部分省份均有發(fā)生和流行，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。加強(qiáng)對(duì)該病檢測(cè)方法的研究，對(duì)控制傳染性病毒性腺胃炎病的發(fā)生，保護(hù)和促進(jìn)養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。自腺胃炎發(fā)生以來，關(guān)于腺胃炎的病因仍然眾說紛紜，本研究在臨床上遇到的傳染性病毒性腺胃炎病例中分離出了傳染性支氣管炎病毒（IBV）。不同發(fā)病程度的患病雞的剖檢變化不同，對(duì)于病因不詳?shù)牟《拘约膊�，弄清楚病毒侵害的主要靶器官�?duì)于該病的預(yù)防和治療起著至關(guān)重要的作用。因此筆者應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)患病雞的胸腺、肺臟、心臟、腺胃、腎臟、肝臟、腦等器官中病毒的含量做定量分析并進(jìn)行差異顯著性分析。 將連續(xù)盲傳八代的尿囊液進(jìn)行直接血凝試驗(yàn)，病毒無(wú)血凝性，用1%磷脂酶C處理后有血凝性。也通過對(duì)NDV的干擾實(shí)驗(yàn)及RTPCR實(shí)驗(yàn)初步鑒定該病毒為傳染性支氣管炎病毒。首先針對(duì)IBV-N基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出216bp的目的片段，同時(shí)參照已往發(fā)表的文獻(xiàn)合成一對(duì)擴(kuò)增內(nèi)參基因的β-actin引物，大小為139bp。將這兩個(gè)擴(kuò)增的目的片段分別與pEASY-T1Clon...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
前言
    1.1 致病因素
        1.1.1 非傳染性因素
        1.1.2 傳染性因素
            1.1.2.1 國(guó)外研究進(jìn)展
            1.1.2.2 國(guó)內(nèi)研究進(jìn)展
    1.2 與傳染性病毒性腺胃炎相關(guān)的主要病原
        1.2.1 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒
        1.2.2 冠狀病毒
        1.2.3 禽呼腸孤病毒
        1.2.4 馬立克氏病毒
    1.3 流行病學(xué)
    1.4 臨床癥狀
    1.5 病理組織學(xué)變化
        1.5.1 腺胃
        1.5.2 十二指腸
        1.5.3 法氏囊
        1.5.4 腎臟
        1.5.5 胸腺
    1.6 診斷
    1.7 治療
    1.8 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR
        1.8.1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的分類
            1.8.1.1 SYBR GreenI 熒光染料法
            1.8.1.2 TaqMan 探針法
            1.8.1.3 雙雜交探針
            1.8.1.4 分子信標(biāo)
        1.8.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的定量方法
            1.8.2.1 絕對(duì)定量
            1.8.2.2 相對(duì)定量
        1.8.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的應(yīng)用
            1.8.3.1 分子生物學(xué)應(yīng)用
            1.8.3.2 遺傳學(xué)
            1.8.3.3 甲基化分析
            1.8.3.4 SNP 分析
            1.8.3.5 臨床食品及環(huán)境的應(yīng)用
            1.8.3.6 腫瘤基因檢測(cè)
            1.8.3.7 產(chǎn)前診斷
        1.8.4 熒光定量 PCR 的優(yōu)點(diǎn)
    1.9 研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 毒株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 主要溶液及其配制
        2.2.2 病毒的分離
        2.2.3 血凝試驗(yàn)(HA)
        2.2.4 雞胚半數(shù)致死量試驗(yàn)
        2.2.5 病毒對(duì) NDV 的干擾試驗(yàn)
        2.2.6 石蠟切片制作方法
        2.2.7 HE 染色
        2.2.8 IBV 的引物設(shè)計(jì)及目的片段擴(kuò)增
        2.2.9 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.9.1 動(dòng)物組織 RNA 的提取
            2.2.9.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
            2.2.9.3 PCR 反應(yīng)
            2.2.9.4 PCR 產(chǎn)物的膠回收
            2.2.9.5 PCR 產(chǎn)物與 pEASY-T1 Cloning Vector 的連接反應(yīng)
            2.2.9.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（E.coli DH5α）的制備
            2.2.9.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.2.9.8 質(zhì)粒 DNA 的提取
            2.2.9.9 重組質(zhì)粒 DNA 的鑒定
                2.2.9.9.1 質(zhì)粒酶切鑒定
                2.2.9.9.2 PCR 鑒定
            2.2.9.10 陽(yáng)性克隆序列測(cè)定
        2.2.10 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的建立
            2.2.10.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備及原始定量
            2.2.10.2 熒光定量 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化
            2.2.10.3 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的反應(yīng)體系及程序
            2.2.10.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.2.10.5 臨床樣品檢測(cè)
                2.2.10.5.1 臨床樣品組織中 RNA 的提取
                2.2.10.5.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
                2.2.10.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)不同器官的病毒拷貝量
3. 結(jié)果
    3.1 病毒的分離與鑒定
        3.1.1 病毒的分離與傳代
        3.1.2 血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1.3 雞胚半數(shù)致死量試驗(yàn)結(jié)果
        3.1.4 病毒對(duì) NDV 的干擾試驗(yàn)
        3.1.5 病理組織學(xué)變化
    3.2 PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.3 陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果
    3.4 熒光定量 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化
    3.5 熒光定量 PCR 檢測(cè)β-actin、N 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
    3.6 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果
    3.7 SPSS 17.0 軟件 Duncan 法對(duì)各器官病毒含量進(jìn)行差異顯著性分析結(jié)果
4. 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
研究生期間發(fā)表論文



本文編號(hào)：3749168