本實(shí)驗(yàn)室從一猝死牛脾臟內(nèi)分離到一株細(xì)菌,經(jīng)鑒定該菌為致病性蠟樣芽孢桿菌。由于目前未有蠟樣芽孢桿菌侵染牛致死的相關(guān)報(bào)道,因此對(duì)菌株進(jìn)行分離鑒定,并針對(duì)該菌的nhe基因建立RPA-LF檢測(cè)法,以期對(duì)該病的研究及防控提供理論依據(jù)。試驗(yàn)通過(guò)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀(guān)察、生化檢測(cè)、16S rDNA及groEL基因序列分析等方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。經(jīng)藥物敏感性、耐酸耐膽鹽性、耐高溫性、動(dòng)物致病性及感染鼠病理組織切片觀(guān)察等試驗(yàn)對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)。之后通過(guò)PCR檢測(cè)及堿基序列測(cè)定對(duì)該菌所含毒力基因進(jìn)行檢測(cè)分析,再針對(duì)該菌的毒力基因nhe建立RPA-LF快速檢測(cè)法。試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),該菌為革蘭氏陽(yáng)性桿菌,呈單個(gè)或鏈狀排列,生化檢測(cè)、16S rDNA及groEL基因分析表明該菌株為蠟樣芽孢桿菌;生物學(xué)特性檢測(cè)結(jié)果顯示該菌對(duì)頭孢氨芐、慶大霉素、諾氟沙星等藥物敏感,具有耐酸性、不耐膽鹽、與其他蠟樣芽孢桿菌相比耐高溫性不強(qiáng),對(duì)小鼠有較強(qiáng)的致死性且可導(dǎo)致小鼠各臟器發(fā)生不同程度的病變;毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明該菌含有毒素hbl、nhe、entFM、cytk的毒力基因:經(jīng)優(yōu)化,nhe基因RPA-LF檢測(cè)法的最佳反應(yīng)溫度為38℃、最低有效...

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 引言
    1.1 蠟樣芽孢桿菌的概述
    1.2 蠟樣芽孢桿菌毒素的概述
        1.2.1 嘔吐型腸毒素
        1.2.2 腹瀉型腸毒素
        1.2.3 細(xì)胞毒素K
        1.2.4 腸毒素Ⅱ
    1.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)
        1.3.1 RPA反應(yīng)原理
        1.3.2 引物設(shè)計(jì)原則
        1.3.3 常見(jiàn)檢測(cè)方法
2 試驗(yàn)材料
    2.1 主要試劑及儀器
    2.2 菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
3 試驗(yàn)方法
    3.1 目的及意義
    3.2 技術(shù)路線(xiàn)
    3.3 細(xì)菌的分離鑒定
        3.3.1 培養(yǎng)基的制備
        3.3.2 細(xì)菌的分離純化
        3.3.3 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征觀(guān)察
        3.3.4 細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)
        3.3.5 分離菌的藥敏檢測(cè)
        3.3.6 分離菌的抑菌試驗(yàn)
        3.3.7 耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)
        3.3.8 耐高溫試驗(yàn)
        3.3.9 分離菌16SrDNA檢測(cè)
        3.3.10 分離菌致病性檢測(cè)
        3.3.11 感染鼠病理組織學(xué)觀(guān)察
    3.4 分離菌毒力基因鑒定
        3.4.1 毒力基因的檢測(cè)
        3.4.2 毒力基因的對(duì)比分析
    3.5 非溶血性腸毒素RPA檢測(cè)方法的建立
        3.5.1 引物及探針的設(shè)計(jì)
        3.5.2 RPA-LF反應(yīng)體系的建立
        3.5.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化
        3.5.4 特異性試驗(yàn)
        3.5.5 靈敏性試驗(yàn)
4 試驗(yàn)結(jié)果
    4.1 細(xì)菌的分離鑒定
        4.1.1 培養(yǎng)及鏡檢
        4.1.2 生理生化特性
        4.1.3 藥物敏感性
        4.1.4 抑菌性
        4.1.5 耐酸、耐膽鹽性
        4.1.6 耐高溫性
        4.1.7 16S rDNA檢測(cè)
        4.1.8 致病性檢測(cè)
        4.1.9 感染鼠病理組織學(xué)觀(guān)察
    4.2 毒力基因鑒定
        4.2.1 毒力基因的PCR擴(kuò)增
        4.2.2 毒力基因遺傳變異分析
    4.3 非溶血性腸毒素RPA-LF的建立
        4.3.1 RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化
        4.3.2 特異性試驗(yàn)
        4.3.3 靈敏性試驗(yàn)
5 討論
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
附錄



本文編號(hào)：3738664