沙門氏菌鞭毛蛋白是構(gòu)成菌體鞭毛的單體蛋白,它不僅是細菌運動和黏附的重要組成原件,也是天然Toll樣受體5 （Toll-like receptor, TLR）的激動劑,能夠與TLR5結(jié)合激活MyD88信號途徑,引起IL-8等細胞因子分泌增多,增強免疫細胞分化增殖等效應。雖然其本身具有沙門氏菌H抗原表位區(qū)域,卻不影響其佐劑作用的發(fā)揮,甚至可作為自身佐劑增強鞭毛的抗原性,因此,自1998年其佐劑作用被發(fā)現(xiàn)以來,一直是疫苗免疫增強劑的研究熱點,多項研究顯示鞭毛蛋白能夠增強原核和真核表達蛋白抗原的抗原性,通過對天然免疫因子的調(diào)節(jié)增強特異性免疫應答。干酪乳桿菌是安全級微生物（generally regarded as safe,GRAS）的益生菌,因其菌體成分和分泌物能夠明顯促進黏膜和體液免疫,亦是疫苗佐劑候選者。本研究利用重組鞭毛蛋白的免疫增強作用,通過以傳染性法氏囊病毒（IBDV）為抗原模型,探討了鞭毛蛋白對不同形式疫苗的免疫增強作用,結(jié)合干酪乳桿菌外源蛋白表達系統(tǒng)無毒素殘留、菌體及分泌成分具有益生作用的優(yōu)勢,以期獲得純化步驟簡單、易于生產(chǎn)的重組鞭毛蛋白作為疫苗免疫佐劑的候選者。利用PCR方法... 

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 沙門氏菌鞭毛蛋白的概況
        1.1.1 鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.2 鞭毛蛋白與天然免疫
        1.1.3 鞭毛蛋白與獲得性免疫
    1.2 沙門氏菌鞭毛蛋白的佐劑作用
        1.2.1 鞭毛蛋白作為佐劑的研究進展
        1.2.2 鞭毛蛋白作為雞疫苗佐劑的研究
    1.3 乳酸菌表達重組蛋白的優(yōu)勢
        1.3.1 乳酸菌作為疫苗佐劑的潛能
        1.3.2 乳酸菌作為活菌載體表達外源蛋白的研究
        1.3.3 禽為模型的乳酸菌相關研究
    1.4 IBDV疫苗的研究與應用
    1.5 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 病毒、細胞和抗體
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 質(zhì)粒和菌株
        2.1.4 酶類及主要試劑
        2.1.5 引物
        2.1.6 主要儀器設備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 FIiB、FIiBc和IBDV VP2基因片段的克隆
        2.2.2 FliB、FliBc、VP2和FliBc-VP2基因E.coli表達載體的構(gòu)建
        2.2.3 FliB、FliBc、VP2和FliBc-VP2在E.coli中表達和鑒定
        2.2.4 乳酸菌表達載體pPG-2-FliB、pPG-2-FliBc和pPG-2-FliBc-VP2的構(gòu)建
        2.2.5 目的蛋白在干酪乳桿菌L.393中的誘導表達及鑒定
        2.2.6 乳酸菌表達的重組蛋白體外活性檢測
        2.2.7 FliBc、VP2和FliBc-VP2重組蛋白的純化和免疫
        2.2.8 pPG-2-FliB/L.casei393和pPG-2-FliBc/L.casei393培養(yǎng)上清的處理并和IBDV弱毒疫苗配合的免疫
        2.2.9 乳酸菌活載體疫苗的制備和免疫
        2.2.10 疫苗免疫效果的評估
3 實驗結(jié)果
    3.1 IBDV-VP2、FliB和FliBc基因的克隆
        3.1.1 FliB和FliBc基因的克隆
        3.1.2 IBDV-VP2基因的克隆
    3.2 FliBc、VP2和FliBc-VP2基因E.coli表達載體的構(gòu)建
        3.2.1 Ppro-HTa-FliB和Ppro-HTa-FliBc的構(gòu)建
        3.2.2 重組載體Ppro-HTa-VP2的構(gòu)建
        3.2.3 重組載體Ppro-HTa-FliBc-VP2的構(gòu)建
    3.3 重組E.coli的誘導表達和鑒定
        3.3.1 鞭毛蛋白Fli的多克隆抗體的制備
        3.3.2 E.coli表達重組蛋白FliB和FliBc的表達鑒定
        3.3.3 Ppro-HTa-VP2/BL21的誘導表達和鑒定
        3.3.4 Ppro-HTa-FliC-VP2/BL21的誘導表達和鑒定
    3.4 重組乳酸菌載體的構(gòu)建與鑒定
        3.4.1 重組載體pPG-2-FliB的構(gòu)建及鑒定
        3.4.2 重組載體pPG-2-FliBc的構(gòu)建及鑒定
        3.4.3 重組載體pPG-2-FliB-VP2的構(gòu)建及鑒定
    3.5 FliB、FliBc和FliBc-VP2基因的乳酸菌表達及鑒定
        3.5.1 pPG-2-FliB/L.casei393、pPG-2-FliBc/L.casei393的誘導表達
        3.5.2 pPG-2-FliBc-VP2/L.casei393的誘導表達
    3.6 乳酸菌表達的重組蛋白FliB和FliBc體外活性檢測
        3.6.1 重組乳酸菌表達蛋白的處理和檢測
        3.6.2 對Caco-2細胞表達TLR-5和IL-8水平的影響
    3.7 FliBc對VP2亞單位疫苗佐劑活性的評估
        3.7.1 亞單位疫苗重組疫苗的純化
        3.7.2 免疫SPF雞血清中特異性IgY的測定
        3.7.3 特異性脾淋巴細胞增殖試驗
        3.7.4 血清中和抗體效價
        3.7.5 攻毒保護性試驗
    3.8 FliBc對IBDV弱毒疫苗佐劑活性的評估
        3.8.1 免疫SPF雞血清中特異性IgY的測定
        3.8.2 特異性脾淋巴細胞增殖試驗
        3.8.3 中和抗體水平
        3.8.4 攻毒保護試驗
    3.9 FliBc對IBDV活載體疫苗佐劑活性的評估
        3.9.1 pPG2-VP2/L.casei393和pPG2-FliBc-VP2/L.casei393免疫SPF雞血清特異性IgY的測定
        3.9.2 特異性脾淋巴細胞增殖活性
        3.9.3 液、氣管灌洗液和腸粘液中分泌型IgA的測定
        3.9.4 中和抗體水平檢測
        3.9.5 攻毒保護試驗
4 討論
    4.1 重組目的蛋白表達條件的優(yōu)化選擇
    4.2 鞭毛蛋白佐劑活性區(qū)域的選擇
    4.3 IBDV作為抗原模型的選擇
    4.4 鞭毛蛋白作為免疫佐劑對亞單位疫苗的免疫增強效應
    4.5 鞭毛蛋白對弱毒疫苗的免疫增強作用
    4.6 鞭毛蛋白作為乳酸菌疫苗的分子佐劑的免疫增強作用
    4.7 鞭毛蛋白應用的潛在價值
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
附錄
攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]細菌鞭毛的致病性及其免疫學應用的研究進展[J]. 郭志燕,周明旭,段強德,朱國強.  微生物學報. 2014(03)
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[3]傳染性法氏囊病病毒檢測系統(tǒng)的建立[J]. 王忠燦,王永山,唐雨德,譚維國,施正良,歐陽偉.  中國獸醫(yī)學報. 2008(09)
[4]傳染性法氏囊病病毒的生態(tài)學與流行病學研究[J]. 周宗安,王永山,鄧小昭,刁振宇,高建,施正良,羅函祿,方元.  中國獸醫(yī)學報. 1998(05)



本文編號：3721930