羊泰勒蟲�。∣vine and caprine theileriosis）是媒介蜱傳播的由泰勒科泰勒屬的原蟲寄生于綿羊和山羊巨噬細胞、淋巴細胞和紅細胞內所引起的疾病的總稱。嚴重影響了畜牧業(yè)的發(fā)展。本研究從呂氏泰勒蟲裂殖子cDNA表達文庫中克隆出T1SP基因,通過構建原核重組表達質粒,進行誘導表達和純化,得到重組rT1SP抗原。經(jīng)Western-blot方法分析證實T1SP表達蛋白的反應性。經(jīng)過真核轉染用激光共聚焦顯微技術對其在Vero細胞中表達蛋白進行定位,最后建立檢測羊泰勒蟲的間接ELISA方法。為今后羊泰勒蟲病的免疫學診斷和基因工程疫苗的研究奠定基礎。 克隆呂氏泰勒蟲（Theileria luwenshuni）T1SP基因的功能區(qū)片段,以呂氏泰勒蟲cDNA表達文庫為模板,PCR擴增出T1SP基因片段,構建成pET-30a-T1SP重組質粒,通過誘導表達,獲得了可溶性表達蛋白,并對其用鎳柱進行親和層析純化,得到重組rT1SP抗原,用Western-blot分析了T1SP表達蛋白與尤氏泰勒蟲（T. uilenbergi）、綿羊泰勒蟲（T. ovis）、以及環(huán)形泰勒蟲（T. an... 

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
英文縮略表
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 泰勒蟲病的概況
        1.1.1 羊泰勒蟲的分類
        1.1.2 羊泰勒蟲的傳播媒介
        1.1.3 泰勒蟲的形態(tài)與致病情況
    1.2 羊泰勒蟲的診斷方法
        1.2.1 血涂片檢查
        1.2.2 聚合酶鏈式反應(PCR)
        1.2.3 間接熒光抗體技術(IFAT)
        1.2.4 半巢式PCR(semi-nested PCR)
        1.2.5 環(huán)介導的恒溫擴增技術(LAMP)
        1.2.6 酶聯(lián)免疫反應技術(ELISA)
    1.3 羊泰勒蟲的研究現(xiàn)狀
    1.4 研究目標
        1.4.1 呂氏泰勒蟲T1SP基因的克隆、生物信息分析和原核表達
        1.4.2 呂氏泰勒蟲T1SP基因在真核細胞的表達與定位
        1.4.3 T1SP抗原的間接ELISA抗體檢測羊泰勒蟲方法的建立
第2章 呂氏泰勒蟲T1SP基因的克隆、生物信息分析和原核表達
    2.1 引言
    2.2 材料、試劑與儀器
        2.2.1 菌株、載體
        2.2.2 試驗試劑
        2.2.3 試驗儀器
        2.2.4 呂氏泰勒蟲T1SP基因的生物信息學分析
    2.3 呂氏泰勒蟲T1SP基因的克隆
        2.3.1 引物設計
        2.3.2 PCR擴增
        2.3.3 膠回收
        2.3.4 pGEM-T Easy載體的連接
        2.3.5 轉化
        2.3.6 pGEM-T-T1SP質粒的提取
    2.4 重組表達質粒pET-30a-T1SP的構建
        2.4.1 雙酶切
        2.4.2 連接
        2.4.3 PCR鑒定
    2.5 pET-30a-T1SP的原核表達
    2.6 表達蛋白的純化與透析
        2.6.1 純化
        2.6.2 透析
    2.7 Western-blot分析
        2.7.1 SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳
        2.7.2 轉膜(半干轉)
    2.8 羊抗T1SP蛋白多抗的制備
    2.9 結果與分析
        2.9.1 T1SP基因的PCR擴增結果
        2.9.2 T1SP基因序列
        2.9.3 T1SP基因翻譯的氨基酸序列
        2.9.4 T1SP基因抗原表位分析預測
        2.9.5 重組蛋白的表達和純化
        2.9.6 Western-blot分析結果
    2.10 討論
    2.11 小結
第3章 呂氏泰勒蟲T1SP基因在真核細胞的表達與定位
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 T1SP基因的引物設計
        3.1.4 PCR擴增
        3.1.5 pEGFP-N1-T1SP重組質粒的構建
        3.1.6 重組質粒的提取
        3.1.7 Vero細胞的培養(yǎng)與轉染
        3.1.8 細胞爬片的制作與亞細胞定位
        3.1.9 Western-blot分析重組質粒pEGFP-N1-T1SP的表達
    3.2 結果與分析
        3.2.1 T1SP基因的PCR擴增結果
        3.2.2 重組質粒pEGFP-N1-T1SP的PCR鑒定
        3.2.3 脂質體轉染
        3.2.4 重組質粒pEGFP-N1-T1SP在Vero細胞中的定位
        3.2.5 表達與Western-blot分析
    3.3 討論
    3.4 小結
第4章 rT1SP抗原的間接ELISA抗體檢測羊泰勒蟲方法的建立
    4.1 材料與方法
        4.1.1 血清
        4.1.2 抗原的制備
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 試驗儀器
        4.1.5 抗原的最佳包被濃度
        4.1.6 血清和酶標抗體的稀釋度
        4.1.7 間接ELISA判定標準
        4.1.8 交叉反應檢測
        4.1.9 臨床樣品檢測
    4.2 結果與分析
        4.2.1 抗原的最佳包被濃度
        4.2.2 血清和酶標抗體的稀釋度
        4.2.3 臨界值的判定標準
        4.2.4 交叉反應結果
        4.2.5 臨床樣品檢測結果
        4.2.6 rT1SP蛋白多抗的持續(xù)時間
    4.3 討論
    4.4 小結
結論
參考文獻
致謝
附錄A 攻讀學位期間所發(fā)表的學術論文目錄


【參考文獻】：
期刊論文
[1]中國部分地區(qū)羊泰勒蟲病的流行病學調查及分類鑒定[J]. 李有全,彭欲率,劉志杰,關貴全,楊吉飛,陳澤,牛慶麗,羅建勛,殷宏.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2012(16)
[2]牛環(huán)形泰勒蟲GST-Tams1融合蛋白間接ELISA檢測方法的建立[J]. 簡子健,馬素貞,黃家雨,孫其吉吉,沈炯玉,苗中秋,呂偉.  新疆農(nóng)業(yè)科學. 2011(03)
[3]Asia 1型FMDV感染BHK-21細胞差異蛋白質點2-DE分析[J]. 劉永杰,張克山,尚佑軍,郭建宏,鄭海學,田宏,盧國棟,劉湘濤.  畜牧獸醫(yī)學報. 2011(01)
[4]綠色熒光蛋白標記結合激光共聚焦顯微鏡三維重建技術觀測組織工程骨的構建和體內移植[J]. 侯天勇,邊巴羅布,羅飛,吳雪暉,靳慧勇,姜恒,許建中.  中國修復重建外科雜志. 2010(07)
[5]H3N8亞型馬流感病毒間接ELISA抗體檢測方法建立及應用[J]. 郭巍,王英原,王宇,張馨心,趙立平,王立群,相文華.  中國預防獸醫(yī)學報. 2010(03)
[6]羊泰勒蟲主要表面蛋白P32基因的克隆及真核表達載體的構建[J]. 劉愛紅,關貴全,劉軍龍,李有全,馬米玲,牛慶麗,任巧云,殷宏,羅建勛.  動物醫(yī)學進展. 2009(12)
[7]我國羊泰勒蟲病及其基因工程疫苗研究進展[J]. 張寶,李有全,羅建勛,殷宏.  動物醫(yī)學進展. 2009(03)
[8]呂氏泰勒蟲cDNA表達文庫的構建及其抗原基因的免疫篩選[J]. 李有全,羅建勛,高金亮,關貴全,馬米玲,劉志杰,劉軍龍,劉愛紅,任巧云,黨志勝,魯炳義,劉光遠,白啟,殷宏.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2009(01)
[9]陽離子脂質體介導的重組pEGFP-N1-IGF-1質粒體內轉染在損傷后脊髓組織內的表達[J]. 李紅宇,高松,王瑩,袁文,張競,呂碧濤,徐盛明.  脊柱外科雜志. 2006(04)
[10]甘南地區(qū)羊泰勒蟲病的預防與治療試驗[J]. 郭淑珍,馬登錄,牟永娟,楊樹猛,王文飆,格桂花,尕旦吉,方百乾,趙春生.  中國獸醫(yī)寄生蟲病. 2006(03)

博士論文
[1]我國羊泰勒蟲的生物學特性研究[D]. 李有全.中國農(nóng)業(yè)科學院 2007



本文編號：3721268