發(fā)布時間：2022-11-01 21:03

　　pPG612是一種乳酸菌和大腸桿菌穿梭表達(dá)載體,但因其拷貝數(shù)較低,而且需要添加誘導(dǎo)劑才能誘導(dǎo)蛋白表達(dá),不方便在生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用,因此本實驗在pPG612表達(dá)載體的基礎(chǔ)上加以改造,預(yù)期得到一個可高水平表達(dá)外源蛋白、不需添加誘導(dǎo)物的組成型表面表達(dá)載體。 產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥、人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽及人類食物中毒的主要病原菌之一,該菌的致病因子是其所產(chǎn)生的外毒素。各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生α毒素（C.perfringens alpha-toxin, CPA）,它是產(chǎn)氣莢膜梭菌最重要的致病毒素之一,利用構(gòu)建的組成型乳酸菌表達(dá)載體對去毒后的α毒素進(jìn)行表達(dá),篩選高表達(dá)量的組成型乳酸菌表達(dá)載體系統(tǒng),為構(gòu)建新型重組乳酸菌活菌疫苗防治該病提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 本實驗中,構(gòu)建了一個無需誘導(dǎo)的可表面表達(dá)a毒素蛋白的干酪乳桿菌組成型表達(dá)載體。以pPG612載體質(zhì)粒為基本框架,將其原有表達(dá)元件替換為HCE啟動子、PgsA anchor、 rrnBT1T2終止子,改造后載體命名為pPG-PPT,將α毒素基因片段插入到表達(dá)載體pPG-PPT中,... 

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 乳酸菌作為載體疫苗的研究進(jìn)展
        1.1.1 乳酸菌的應(yīng)用
        1.1.2 乳酸菌的腸道黏附作用
        1.1.3 干酪乳桿菌
    1.2 組成型與誘導(dǎo)型表達(dá)載體的研究進(jìn)展
    1.3 乳酸菌載體表達(dá)元件
        1.3.1 乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)成
        1.3.2 本實驗中組成型表達(dá)盒的構(gòu)成元件
    1.4 翻譯增強(qiáng)子的簡介及其在表達(dá)載體中的應(yīng)用
        1.4.1 轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子
        1.4.2 翻譯增強(qiáng)子
    1.5 產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的研究進(jìn)展
    1.6 實時熒光定量PCR方法的應(yīng)用
    1.7 流式細(xì)胞術(shù)在基因表達(dá)分析中的應(yīng)用
    1.8 研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 質(zhì)粒與菌種
        2.1.2 抗體制劑
        2.1.3 實驗動物
        2.1.4 引物
        2.1.5 主要生物學(xué)試劑
        2.1.6 培養(yǎng)基
        2.1.7 主要儀器與設(shè)備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 目的基因的獲得
        2.2.2 PgsA anchor多克隆抗體的制備
        2.2.3 重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建
        2.2.4 重組干酪乳桿菌PgsA anchor和α毒素融合表達(dá)蛋白鑒定
        2.2.5 重組干酪乳桿菌表達(dá)載體的優(yōu)化
        2.2.6 優(yōu)化后重組菌蛋白表達(dá)的鑒定及其與優(yōu)化前重組菌蛋白表達(dá)情況的比較分析
3 結(jié)果
    3.1 目的基因的克隆與序列測定
        3.1.1 目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.1.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果
    3.2 PgsA anchor多克隆抗體的制備
        3.2.1 原核表達(dá)載體pET-32a-PgsA的構(gòu)建
        3.2.2 PgsA anchor基因在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定
        3.2.3 重組蛋白表達(dá)鑒定及純化
        3.2.4 間接ELISA檢測重組PgsA anchor抗血清效價
    3.3 重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
        3.3.1 重組干酪乳桿菌表達(dá)載體pPG-PPT與pPG-PPαT的構(gòu)建圖譜
        3.3.2 表達(dá)α毒素的重組干酪乳桿菌的構(gòu)建
    3.4 重組干酪乳桿菌PgsA anchor和α毒素融合表達(dá)蛋白的鑒定
        3.4.1 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定
        3.4.2 表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot鑒定
    3.5 重組干酪乳桿菌表達(dá)載體的優(yōu)化
        3.5.1 重組質(zhì)粒pMD18-TS-T7g10、pMD18-TS-Ω的酶切鑒定
        3.5.2 重組菌pPG-T7g10-PPαT/TG1、pPG-Ω-PPαT/TG1的鑒定
        3.5.3 重組干酪乳桿菌pPG-T7g1 0-PPαT/L.casei 393、pPG-Ω-PPαT/L.casei 393
    3.6 優(yōu)化后重組菌蛋白表達(dá)的鑒定及其與優(yōu)化前重組菌蛋白表達(dá)情況的比較分析
        3.6.1 表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot鑒定
        3.6.2 表達(dá)產(chǎn)物的間接ELISA鑒定
        3.6.3 重組菌中mRNA熒光定量PCR相對定量分析
        3.6.4 表達(dá)產(chǎn)物流式細(xì)胞術(shù)檢測
        3.6.5 表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光定位檢測
        3.6.6 表達(dá)產(chǎn)物的激光共聚焦定位檢測
4 討論
    4.1 PgsA anchor與α毒素蛋白融合表達(dá)
    4.2 T7g10與omega增強(qiáng)子的插入
    4.3 三種重組菌α毒素蛋白表達(dá)量ELISA結(jié)果比較分析
    4.4 三種重組菌mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較分析
    4.5 重組菌的蛋白表達(dá)量流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果比較分析
    4.6 重組菌表面表達(dá)蛋白的間接免疫熒光與激光共聚焦分析
    4.7 熒光定量PCR方法的應(yīng)用
    4.8 組成型乳酸菌表面表達(dá)載體的應(yīng)用前景
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3700096