產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）是引起新生仔豬腹瀉的主要病原。本研究從江蘇和江西兩省部分地區(qū)的規(guī)�；i場發(fā)生腹瀉的新生仔豬中分離得到攜帶菌毛基因的大腸桿菌并對菌毛基因型的分布特征進行了分析。利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中分別表達了F4、F5、F6菌毛亞單位基因faeG、fanC、fas A并驗證了重組菌毛蛋白的免疫原性。以純化的重組F4菌毛蛋白作為檢測抗原建立了間接ELISA方法,并初步應(yīng)用于臨床檢測。本文研究內(nèi)容如下：1仔豬腸致病性大腸桿菌的分離和鑒定2012年10月至2013年9月間,從江蘇、江西2省部分地區(qū)的13家豬場采集臨床疑似新生仔豬腹瀉糞樣146份,從中分離、鑒定出116株大腸桿菌。根據(jù)GenBank發(fā)表的大腸桿菌F4、F5、F6菌毛的基因序列分別設(shè)計特異性引物,對116株致仔豬腹瀉大腸桿菌的菌毛基因進行PCR檢測。結(jié)果有20株（17%）大腸桿菌檢測出F4菌毛基因,6株（5.2%）檢測出F5菌毛基因,19株（16%）檢測出F6菌毛基因,有5株（4.3%）大腸桿菌同時檢測出2種菌毛基因。通過溶血性試驗發(fā)現(xiàn),有13株（10%）大腸桿菌完全溶血,6株（5.2%）不完全溶血。通過分析菌毛... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 文獻綜述
    第一章 仔豬黃白痢的研究進展
        1 仔豬黃白痢的病原學
        2 仔豬黃白痢的發(fā)病特征
        3 仔豬黃白痢的流行情況
        參考文獻
    第二章 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌毛的研究進展
        1 菌毛的主要類型
            1.1 F4菌毛
            1.2 F5菌毛
            1.3 F6菌毛
        2 菌毛的生化特性
        3 菌毛的表達條件
        4 菌毛的流行病學分布
        參考文獻
    第三章 仔豬黃白痢的防治
        1 加強飼養(yǎng)管理
        2 微生態(tài)制劑治療
        3 抗生素治療
        4 疫苗預(yù)防
            4.1 全菌滅活疫苗
            4.2 亞單位疫苗
            4.3 基因工程疫苗
            4.4 ETEC疫苗的展望
        參考文獻
第二部分 試驗研究
    第四章 仔豬腸致病性大腸桿菌的分離和鑒定
        1 材料與方法
            1.1 病料樣本采集
            1.2 培養(yǎng)基
            1.3 其他試劑
            1.4 參考菌株
            1.5 PCR引物
            1.6 細菌的分離與純培養(yǎng)
            1.7 革蘭氏染色鏡檢
            1.8 生化試驗
            1.9 PCR模板的制備
            1.10 PCR檢測菌毛基因
        2 結(jié)果
            2.1 細菌分離和生化鑒定
            2.2 分離菌株的菌毛基因檢測
            2.3 分離菌株的溶血性與菌毛類型的相關(guān)性
        3 討論
        參考文獻
    第五章 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4、F5和F6菌毛亞單位基因的克隆表達
        1 材料與方法
            1.1 菌株和質(zhì)粒載體
            1.2 主要試劑
            1.3 目的基因的擴增
            1.4 PCR產(chǎn)物的克隆與轉(zhuǎn)化
            1.5 目的蛋白的誘導表達及SDS-PAGE檢測
            1.6 重組蛋白表達形式的鑒定
            1.7 重組蛋白的純化與復性
            1.8 純化產(chǎn)物的Western-blot分析
        2 結(jié)果
            2.1 faeG、fanC及fasA的PCR擴增
            2.2 重組原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.3 faeG、fanC、fasA基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導表達
            2.4 重組蛋白的純化與復性
            2.5 重組蛋白表達Western-blot鑒定
        3 討論
        參考文獻
    第六章 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4菌毛抗體間接ELISA檢測方法的建立及作用
        1 材料與方法
            1.1 血清及生化試劑
            1.2 免疫血清的制備
            1.3 間接ELISA方法條件的優(yōu)化
            1.4 間接ELISA方法臨界值的確定
            1.5 阻斷試驗
            1.6 特異性試驗
            1.7 重復性試驗
            1.8 符合性試驗
            1.9 臨床樣品檢測
        2 結(jié)果
            2.1 抗原包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定
            2.2 血清最佳作用時間的確定
            2.3 封閉液的確定
            2.4 酶標二抗工作濃度和時間的確定
            2.5 間接ELISA方法臨界值的確定
            2.6 阻斷試驗
            2.7 特異性試驗
            2.8 重復性試驗
            2.9 符合性試驗
            2.10 臨床豬血清檢測
        3 討論
        參考文獻
全文總結(jié)
附錄主要溶液及其配制方法
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]規(guī)�；B(yǎng)豬場仔豬疾病發(fā)生情況調(diào)查報告[J]. 李勝利,劉少華,于省波,黃大鵬.  湖北畜牧獸醫(yī). 2013(11)
[2]產(chǎn)腸毒素大腸桿菌987P菌毛蛋白FasA亞單位的原核表達及其免疫原性[J]. 賀志良,姜柯安,宋方洲,馬永平.  中國生物制品學雜志. 2012(09)
[3]基于重組外膜蛋白P2的副豬嗜血桿菌抗體間接ELISA方法的建立[J]. 李淼,李春玲,葉嚴鋒,宋帥,楊冬霞.  華北農(nóng)學報. 2011(04)
[4]腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌F4ac菌毛蛋白FaeG亞單位的原核表達及免疫學鑒定[J]. 于拽拽,楊致邦,周裕珍,熊玉霞,胡洪銘,蔣任舉.  中國微生態(tài)學雜志. 2011(03)
[5]湖南省規(guī)�；i場豬源大腸桿菌的耐藥性調(diào)查[J]. 覃開權(quán).  中國動物檢疫. 2011(03)
[6]上海市豬源大腸桿菌耐藥性監(jiān)測[J]. 馬全朝,顧欣,程增青,張可煜,金凌艷,薛飛群.  中國動物檢疫. 2009(04)
[7]仔豬黃白痢的預(yù)防和治療[J]. 魏杰,韓方偉,林建平,許磊.  畜牧與獸醫(yī). 2009(03)
[8]產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌致病因子F41、K99菌毛基因的克隆與表達[J]. 聞曉波,崔玉東,冉旭華,朱戰(zhàn)波,樸范澤,潘興廣.  中國人獸共患病學報. 2007(08)
[9]豬圓環(huán)病毒2型Cap羧基端多肽原核表達及抗原性分析[J]. 俞莉俐,姜平,馮志新.  畜牧與獸醫(yī). 2006(11)
[10]產(chǎn)腸毒素性大腸埃希氏菌基因工程疫苗的研究進展[J]. 衛(wèi)廣森,許崇波,孫宇.  中國獸醫(yī)科技. 2005(11)

碩士論文
[1]硫糖鋁在體內(nèi)外對VacA-IgY保護作用的探討[D]. 郭麗媛.重慶醫(yī)科大學 2009
[2]hp1188基因的克隆表達及免疫特性研究[D]. 韓飛.重慶醫(yī)科大學 2009
[3]我國部分地區(qū)致新生仔豬腹瀉大腸桿菌的生物學特性[D]. 苗曉青.揚州大學 2007
[4]幽門螺桿菌重組VacA-CtxB蛋白的原核表達及免疫原性研究[D]. 張任飛.重慶醫(yī)科大學 2007



本文編號：3700028