發(fā)布時間：2022-10-29 11:37

　　鴨疫里默氏桿菌（Riemerella antipestifer, RA）能引起鴨、鵝、火雞等多種禽類發(fā)生鴨疫里默氏桿菌感染,呈急性或慢性敗血性經過。本研究對RA OmpA基因開展了生物信息學分析、克隆表達、蛋白純化、多克隆抗體制備、基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立、重組蛋白免疫原性等研究,主要結果如下：1 RA OmpA基因的生物信息學分析RA OmpA全基因長1208bp,由397個氨基酸編碼大小為43.52kDa的蛋白,等電點（pI）為4.81。該蛋白沒有信號肽切割位點和跨膜區(qū),有如下功能位點：有4個N-糖基化位點,9個蛋白激酶C磷酸化位點,7個酪蛋白激酶II磷酸化位點,3個N-豆蔻酰化位點。亞細胞定位分析該蛋白主要分布于外膜和細胞之內。氨基酸進化樹分析表明該蛋白與黃桿菌科編碼OmpA蛋白的其它成員相似性低。該蛋白的抗原性分析表明第185-337位這段氨基酸有連續(xù)而且強烈的抗原性。2 RA OmpA基因的克隆表達和多抗的制備對RA OmpA基因設計了一對引物,大小為1208bp,構建pJET1.2/OmpA克隆載體及其pET32a（+）OmpA表達載體,轉入表達菌株BL21... 

【文章頁數】：58 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫詞匯及其含義說明
一、引言
    1 鴨疫里默氏桿菌研究概況
    2 OmpA基因編碼蛋白的特點
        2.1 OmpA蛋白的結構特點
        2.2 OmpA蛋白的功能
            2.2.1 致病作用
            2.2.2 支撐細胞外膜骨架
            2.2.3 參與生物膜的形成
            2.2.4 作為外源蛋白的表面呈現載體
            2.2.5 免疫原性
    3 OmpA的基因特點
    4 OmpA其它特性
        4.1 中性粒細胞彈性蛋白酶降解外膜蛋白殺滅大腸桿菌
        4.2 膜間質分子伴侶Skp捕獲外膜蛋白
        4.3 外膜蛋白參與革蘭氏陰性菌對異丙醇耐受的調節(jié)
    5 研究的目的和意義
二、試驗研究
    1 材料
        1.1 菌株、菌種、質粒、血清和動物
        1.2 試劑
        1.3 主要溶液的配制
            1.3.1 RA基因組提取相關試劑
            1.3.2 基因克隆相關試劑
            1.3.3 基因表達相關試劑
            1.3.4 弗氏不完全佐劑的配制
            1.3.5 Western-blot相關試劑的配制
            1.3.6 ELISA相關溶液的配制
        1.4 主要儀器設備
    2 方法
        2.1 鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的生物信息學分析
        2.2 RA OmpA基因的克隆和表達
            2.2.1 細菌培養(yǎng)及基因組DNA的提取
            2.2.2 RA OmpA基因引物設計與擴增
            2.2.3 DH5 α感受態(tài)的制備、重組T克隆質粒pJET1.2/OmpA的構建及鑒定
            2.2.4 原核表達pET-32a(+)/OmpA重組質粒的構建和鑒定
            2.2.5 重組表達質粒pET-32a(+)/OmpA的表達
            2.2.6 OmpA重組表達蛋白誘導條件的優(yōu)化
        2.3 OmpA重組表達蛋白的純化及鑒定
            2.3.1 OmpA重組表達蛋白的純化
            2.3.2 OmpA重組表達蛋白的鑒定
            2.3.3 兔抗重組OmpA蛋白多克隆抗體的制備
            2.3.4 兔抗OmpA IgG的純化與鑒定
        2.4 基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立
            2.4.1 鴨抗鴨疫里默氏桿菌ATCC株陽性血清的制備
            2.4.2 間接ELISA的基本操作程序
            2.4.3 抗原的最佳包被濃度和陰陽性血清最佳稀釋度的確定
            2.4.4 酶標二抗最佳工作濃度的確定
            2.4.5 酶標二抗作用時間的確定
            2.4.6 陰陽性血清最佳作用時間的確定
            2.4.7 封閉液的確定
            2.4.8 底物最佳作用時間確定
            2.4.9 陰陽性臨界值的確定
            2.4.10 重復性試驗
            2.4.11 特異性試驗
            2.4.12 符合性試驗
        2.5 重組表達蛋白的免疫原性研究
            2.5.1 體液免疫水平的檢測
            2.5.2 細胞免疫水平的檢測
    3 結果
        3.1 鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的生物信息學分析
            3.1.1 RA OmpA蛋白質的組分析
            3.1.2 信號肽切割位點和跨膜區(qū)預測
            3.1.3 抗原性分析
            3.1.4 功能位點預測
            3.1.5 蛋白質亞細胞定位分析
            3.1.6 二級結構預測與密碼子氨基酸序列保守結構域預測
            3.1.7 密碼子偏性分析
            3.1.8 系統(tǒng)進化樹分析
        3.2 RA OmpA基因克隆表達、蛋白純化及抗體制備
            3.2.1 RA OmpA基因的擴增、T克隆及亞克隆的構建
            3.2.2 OmpA基因誘導表達、純化及Western blot檢測重組蛋白
            3.2.3 兔抗RA OmpA抗體效價的檢測及抗體IgG的粗提
        3.3 基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立
            3.3.1 抗原的最佳包被濃度和陰陽性血清最佳稀釋度的確定
            3.3.2 酶標二抗最佳工作濃度的確定
            3.3.3 酶標二抗作用時間的確定
            3.3.4 陰陽性血清最佳作用時間的確定
            3.3.5 封閉液的確定
            3.3.6 底物最佳作用時間確定
            3.3.7 陰陽性臨界值的確定
            3.3.8 重復性試驗
            3.3.9 特異性試驗
        3.4 重組表達蛋白的免疫原性研究
            3.4.1 人工免疫鴨抗體水平監(jiān)測結果
            3.4.2 細胞因子的檢測結果
    4 討論
        4.1 鴨疫里默氏桿菌OmpA基因的生物信息學分析
        4.2 RA OmpA基因的克隆表達、蛋白純化及抗體制備
        4.3 基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立
        4.4 重組表達蛋白的免疫原性研究
三、結論
參考文獻
致謝
作者簡介及攻讀碩士學位期間論文發(fā)表



本文編號：3697618