弓形蟲(chóng)是頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)中一種極具代表性的人獸共患病原。作為單細(xì)胞寄生蟲(chóng),它可以感染幾乎所有的溫血?jiǎng)游锖瓦@些宿主所有的有核細(xì)胞。為了適應(yīng)如此廣泛的細(xì)胞類(lèi)型和宿主范圍,弓形蟲(chóng)依賴(lài)一大批分泌蛋白來(lái)介導(dǎo)蟲(chóng)體與宿主的互作,以滿(mǎn)足蟲(chóng)體在不同寄生條件下的生長(zhǎng)需求。致密顆粒蛋白（GRAs）和棒狀體蛋白（ROPs）是其中兩類(lèi)重要的分泌蛋白,在蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育和免疫逃避過(guò)程中發(fā)揮重要作用。截至目前,GRAs的家族成員研究不多,其組分有待挖掘;另一方面,大批ROPs已被發(fā)現(xiàn),但其工作的分子機(jī)制并不十分清楚。因此,本研究采用蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)來(lái)發(fā)掘新的致密顆粒蛋白,用酵母雙雜交技術(shù)篩選與弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白互作的宿主蛋白,具體的研究?jī)?nèi)容包括以下兩個(gè)方面:（1）新型致密顆粒蛋白的篩選、鑒定和功能研究采用APEX和BirA*這兩種基于鄰近原則的蛋白標(biāo)記技術(shù),以已知的致密顆粒蛋白GRA1作為誘餌,我們對(duì)弓形蟲(chóng)潛在的GRA蛋白進(jìn)行了生物素標(biāo)記,并最終成功鑒定得到46個(gè)蛋白,其中包括20個(gè)已知的GRA蛋白和26個(gè)候選的GRAs。在這46個(gè)蛋白中,有17個(gè)是APEX和BirA*兩種方法共同鑒定得到的,而這17個(gè)蛋白中有14個(gè)是已知的... 

【文章頁(yè)數(shù)】：126 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
第一章 前言
    1.1 弓形蟲(chóng)概述
        1.1.1 弓形蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)病
        1.1.2 弓形蟲(chóng)的生活史
        1.1.3 弓形蟲(chóng)的宿主范圍和流行病學(xué)
    1.2 弓形蟲(chóng)分泌蛋白的研究進(jìn)展
        1.2.1 弓形蟲(chóng)的分泌蛋白類(lèi)型
        1.2.2 弓形蟲(chóng)完成胞內(nèi)生長(zhǎng)周期需要分泌蛋白的協(xié)助
        1.2.3 弓形蟲(chóng)依賴(lài)分泌蛋白介導(dǎo)與宿主的互作
    1.3 蛋白標(biāo)記技術(shù)研究進(jìn)展
        1.3.1 生物素——親和素系統(tǒng)
        1.3.2 生物素標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用
        1.3.3 其它標(biāo)記技術(shù)
    1.4 蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.4.1 酵母雙雜交技術(shù)
        1.4.2 免疫共沉淀技術(shù)
        1.4.3 Pull-down技術(shù)
        1.4.4 其它方法
    1.5 研究目的和意義
第二章 新型致密顆粒蛋白的篩選、鑒定和功能研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 蟲(chóng)株、菌株和細(xì)胞
        2.1.3 質(zhì)粒
        2.1.4 引物
        2.1.5 主要儀器與試劑
        2.1.6 主要溶液及配制
        2.1.7 實(shí)驗(yàn)方法
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 生物素標(biāo)記質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 生物素標(biāo)記蟲(chóng)株的構(gòu)建
        2.2.3 融合蛋白GRA1-APEX/BirA*的表達(dá)檢測(cè)
        2.2.4 生物素標(biāo)記蛋白的檢測(cè)
        2.2.5 標(biāo)記蛋白的富集純化
        2.2.6 蛋白質(zhì)譜分析
        2.2.7 新型致密顆粒蛋白的鑒定
        2.2.8 候選蛋白的定位分析
        2.2.9 致密顆粒蛋白的功能研究
    2.3 討論
        2.3.1 誘餌蛋白的選取、表達(dá)和比較
        2.3.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理
        2.3.3 候選致密顆粒蛋白的分析
        2.3.4 依賴(lài)APEX和 BirA*催化的生物素標(biāo)記技術(shù)在弓形蟲(chóng)的應(yīng)用
        2.3.5 APEX和 BirA*兩方法的比較
    2.4 小結(jié)
第三章 與棒狀體蛋白R(shí)OP16 互作宿主蛋白的篩選和鑒定
    3.1 材料與方法
        3.1.1 菌株和細(xì)胞
        3.1.2 質(zhì)粒
        3.1.3 引物
        3.1.4 主要儀器與試劑
        3.1.5 實(shí)驗(yàn)方法
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.2 誘餌質(zhì)粒的自激活和毒性
        3.2.3 誘餌蛋白的表達(dá)檢測(cè)
        3.2.4 互作宿主蛋白的篩選
        3.2.5 互作結(jié)構(gòu)域的確定
        3.2.6 相互作用的驗(yàn)證
    3.3 討論
        3.3.1 酵母雙雜交系統(tǒng)的選擇
        3.3.2 與ROP16 互作蛋白的篩選
    3.4 小結(jié)
第四章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄



本文編號(hào)：3661491