胚胎軟骨分化因子1(（Differentiated embryo-chondrocyte1, DEC1）是bHLH家族成員之一,參與體內(nèi)神經(jīng)生成、腫瘤生成、軟骨發(fā)育、低氧應(yīng)激和代謝綜合癥發(fā)生等多個過程。近來,有研究發(fā)現(xiàn)DEC1在肌肉發(fā)育和脂肪沉積方面同時發(fā)揮著重要作用,而肌肉發(fā)育和脂肪沉積是肉用家畜最重要的兩個性狀。因此,DEC1基因很可能是影響肉牛經(jīng)濟(jì)性狀的重要遺傳標(biāo)記基因,而其影響肌肉發(fā)育和脂肪沉積的分子機(jī)制研究也非常必要�；诖�,本研究利用熒光定量PCR、基因克隆、腺病毒包裝、Western blot、細(xì)胞免疫熒光、細(xì)胞培養(yǎng)以及雙熒光素酶報告系統(tǒng)等實驗技術(shù),綜合分析了牛DEC1在肌肉發(fā)育和脂肪生成中的作用及其分子機(jī)制,研究內(nèi)容包括牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定,牛DEC1基因在不同組織及肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程中表達(dá)模式分析,DEC1誘導(dǎo)劑CoCl2對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的影響,牛DEC1基因的克隆及對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的調(diào)控,牛MyoG基因啟動子活性分析及DEC1對MyoG啟動子活性的調(diào)控,過表達(dá)DEC1對脂肪細(xì)胞分化的影響及其調(diào)控機(jī)制,牛DEC1基因多態(tài)性及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析。本研... 

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻(xiàn)綜述
    第一章 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞起源及其調(diào)控機(jī)制
        1.1 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的特性與來源
        1.2 影響肌肉衛(wèi)星細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
            1.2.1 盒轉(zhuǎn)錄因子3
            1.2.2 盒轉(zhuǎn)錄因子7
            1.2.3 Myf5和MyoD
            1.2.4 MyoG和MRF4
        1.3 影響肌肉衛(wèi)星細(xì)胞分化的其它因素
            1.3.1 Notch通路
            1.3.2 MiRNAs
            1.3.3 低氧環(huán)境應(yīng)激(Hypoxia)
            1.3.4 細(xì)胞之間的互作
    第二章 脂肪細(xì)胞的起源及其調(diào)控機(jī)制
        2.1 脂肪的起源與形成過程
            2.1.1 脂肪的起源
            2.1.2 脂肪細(xì)胞分化過程
        2.2 脂肪細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子
            2.2.1 PPARg
            2.2.2 KLFs
            2.2.3 SREBPs
            2.2.4 C/EBP
    第三章 DEC1的分子特性及對肌肉發(fā)育和脂肪沉積的調(diào)控
        3.1 bHLH蛋白的分類
        3.2 DEC1的分子特性與生理功能
            3.2.1 DEC1基因的分子特性
            3.2.2 DEC1與DEC2
            3.2.3 DEC1基因的結(jié)構(gòu)與生理功能
        3.3 DEC1參與肌肉再生和肌肉發(fā)育調(diào)控
        3.4 DEC1調(diào)控脂肪細(xì)胞分化
實驗研究
    第四章 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
        4.1 材料與方法
            4.1.1 試驗動物
            4.1.2 試驗試劑和材料
            4.1.3 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離
            4.1.4 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代
            4.1.5 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的免疫熒光鑒定
        4.2 結(jié)果與分析
            4.2.1 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞最佳消化分離方法
            4.2.2 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
            4.2.3 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞免疫熒光鑒定
        4.3 討論
        4.4 小結(jié)
    第五章 牛DEC1基因在不同組織及肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程中表達(dá)模式分析
        5.1 材料與方法
            5.1.1 試驗動物與組織樣品的采取
            5.1.2 試驗試劑和材料
            5.1.3 牛骨骼肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
            5.1.4 組織和細(xì)胞RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成
            5.1.5 熒光定量PCR檢測
            5.1.6 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
        5.2 結(jié)果與分析
            5.2.1 DEC1在牛不同發(fā)育階段各組織的表達(dá)差異
            5.2.2 DEC1在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式分析
        5.3 討論
        5.4 小結(jié)
    第六章 COCl_2誘導(dǎo)DEC1表達(dá)同時抑制牛肌衛(wèi)星細(xì)胞分化
        6.1 材料與方法
            6.1.1 試驗試劑
            6.1.2 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
            6.1.3 細(xì)胞總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成
            6.1.4 熒光定量PCR檢測
            6.1.5 Western-blot檢測
            6.1.6 細(xì)胞免疫熒光染色檢測
            6.1.7 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
        6.2 結(jié)果與分析
            6.2.1 在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞生長培養(yǎng)基中添加COCl_2對相關(guān)基因mRNA表達(dá)的調(diào)控
            6.2.2 在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中添加COCl_2對相關(guān)基因mRNA表達(dá)的調(diào)控
            6.2.3 Western blot檢測在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中添加CoCl_2對MyoG基因蛋白水平表達(dá)的調(diào)控
            6.2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中添加CoCl_2對MyoG基因蛋白水平表達(dá)的調(diào)控
        6.3 討論
        6.4 小結(jié)
    第七章 牛DEC1基因的克隆及對肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的調(diào)控
        7.1 材料與方法
            7.1.1 試驗材料與試劑
            7.1.2 牛DEC1基因CDS區(qū)的克隆
            7.1.3 牛DEC1過表達(dá)載體構(gòu)建與腺病毒包裝
            7.1.4 DEC1重組腺病毒感染牛肌衛(wèi)星細(xì)胞
            7.1.5 實時定量PCR檢測
            7.1.6 Western blot檢測
            7.1.7 細(xì)胞免疫熒光檢測
            7.1.8 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
        7.2 結(jié)果與分析
            7.2.1 牛DEC1基因的克隆與序列分析
            7.2.2 穿梭載體pAdTrack-CMV-DEC1和骨架載體pAd-Easy-DEC1的構(gòu)建
            7.2.3 DEC1過表達(dá)腺病毒的包裝與擴(kuò)繁
            7.2.4 DEC1過表達(dá)腺病毒的鑒定
            7.2.5 在普通生長培養(yǎng)基狀態(tài)下DEC1過表達(dá)腺病毒感染牛肌衛(wèi)星細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量
            7.2.6 在誘導(dǎo)分化狀態(tài)下DEC1過表達(dá)腺病毒感染牛肌衛(wèi)星細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)差異
            7.2.7 Western blot檢測在誘導(dǎo)分化狀態(tài)下DEC1過表達(dá)腺病毒感染牛肌衛(wèi)星細(xì)胞后MyoG的表達(dá)
            7.2.8 細(xì)胞免疫熒光檢測在誘導(dǎo)分化狀態(tài)下DEC1過表達(dá)腺病毒感染牛衛(wèi)星細(xì)胞后MyoG的表達(dá)
        7.3 討論
        7.4 小結(jié)
    第八章 牛MyoG基因啟動子活性分析及DEC1對MyoG啟動子活性的調(diào)控
        8.1 材料與方法
            8.1.1 試驗材料與試劑
            8.1.2 MyoG啟動子片段的克隆
            8.1.3 MyoG啟動子不同缺失片段pGL3-MyoGpro載體的構(gòu)建
            8.1.4 DEC1過表達(dá)載體pcDNA3.1-DEC1載體的構(gòu)建
            8.1.5 MyoG啟動子不同缺失片段轉(zhuǎn)錄活性的測定
            8.1.6 DEC1過表達(dá)時MyoG啟動子轉(zhuǎn)錄活性的測定
            8.1.7 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
        8.2 結(jié)果與分析
            8.2.1 MyoG啟動子片段的克隆
            8.2.2 MyoG啟動子片段的生物信息學(xué)分析
            8.2.3 MyoG啟動子不同缺失片段pGL3-MyoGpro載體的構(gòu)建
            8.2.4 DEC1過表達(dá)載體pcDNA3.1-DEC1載體的構(gòu)建
            8.2.5 MyoG啟動子不同缺失片段的活性檢測
            8.2.6 DEC1過表達(dá)抑制MyoG啟動子活性
        8.3 討論
        8.4 小結(jié)
    第九章 過表達(dá)DEC1抑制脂肪細(xì)胞分化并下調(diào)PPARg基因的表達(dá)
        9.1 材料與方法
            9.1.1 試驗材料與試劑
            9.1.2 DEC1過表達(dá)腺病毒感染牛前體脂肪細(xì)胞
            9.1.3 牛前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化與油紅O染色及分光光度計測定
            9.1.4 熒光定量PCR檢測
            9.1.5 DEC1過表達(dá)時pGL3-PPARgPro啟動子轉(zhuǎn)錄活性的測定
            9.1.6 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
        9.2 結(jié)果與分析
            9.2.1 牛DEC1過表達(dá)抑制脂肪細(xì)胞分化
            9.2.2 DEC1過表達(dá)對PPARg,FABP4,HSL和Perilipin基因mRNA表達(dá)的影響
            9.2.3 DEC1過表達(dá)抑制PPARg啟動子活性
        9.3 討論
        9.4 小結(jié)
    第十章 牛DEC1基因多態(tài)性及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析
        10.1 材料與方法
            10.1.1 試驗動物
            10.1.2 血液基因組DNA的提取
            10.1.3 PCR反應(yīng)所用引物設(shè)計
            10.1.4 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序
            10.1.5 引入酶切引物的設(shè)計
            10.1.6 PCR產(chǎn)物酶切
            10.1.7 瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物的帶型判定
            10.1.8 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
        10.2 結(jié)果與分析
            10.2.1 DEC1基因突變位點(diǎn)掃描與酶切分析
            10.2.2 DEC1基因突變位點(diǎn)遺傳多態(tài)性指標(biāo)
            10.2.3 DEC1基因突變位點(diǎn)與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析
        10.3 討論
        10.4 小結(jié)
結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)
    結(jié)論
    創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄Ⅰ 本研究中所使用的主要試劑和儀器
    附錄Ⅱ 本研究中所使用的主要試驗方法
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]牛MyoG基因啟動子的克隆及功能的初步分析[J]. 王秋華,曹允考,李樹峰,佟慧麗,興孝友,李光鵬,嚴(yán)云勤.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2012(01)
[2]牛肌源性干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定[J]. 韓穎,孔慶然,尹智,魏延昌,張鑫淼,汪亦男,劉忠華.  東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2008(12)

碩士論文
[1]豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)及TRIM55基因的染色體定位、SNP檢測和表達(dá)譜分析[D]. 張定校.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006



本文編號：3655179