豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起一種高度接觸性和高致死性傳染病,給世界各國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重危害。近年來,隨著CSFV研究的深入,新型疫苗的研制和先進診斷方法的出現(xiàn),對控制CSF方面發(fā)揮了巨大作用。NS2-3蛋白是CSFV的非結構蛋白,具有很好的免疫優(yōu)勢。本研究從攜帶豬瘟兔化弱毒（Hog Cholera Lapinized Virus,HCLV）全長基因組c DNA質粒中擴增NS2-3基因的抗原表位集中區(qū)基因,擴增長度為789bp,將其命名為NS2-32。將目的片段和表達載體p PICZαC分別經Eco R I和Xba I限制性內切酶雙酶切,然后連接轉化至大腸桿菌,得到重組表達質粒p PICZαC-NS2-32。經PCR和雙酶切鑒定后進行測序鑒定,重組表達質粒p PICZαC-NS2-32經Sac I限制性內切酶單酶切線性化之后,電擊轉化至P.pastoris工程菌感受態(tài)X-33。篩選出高抗性陽性菌株,通過改變溫度、培養(yǎng)基p H值、甲醇流加量,摸索誘導表達條件,誘導條件包括:（1）誘導溫度為:22℃、24℃、26℃、28℃;（2）誘導p H值為:4.0、5.0、6.0、7.0... 

【文章頁數】：79 頁

【學位級別】：碩士

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縮略詞表
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1 CSFV的結構和特性
    2 CSFV的侵入機制
    3 CSFV的基因組和編碼蛋白
        3.1 C蛋白
        3.2 E~(rns)蛋白
        3.3 E1蛋白
        3.4 E2蛋白
        3.5 Npro蛋白
        3.6 p7蛋白
        3.7 NS2-3 蛋白
        3.8 NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白
    4 CSF的實驗室診斷
        4.1 動物實驗
        4.2 病毒分離
        4.3 血清學診斷
        4.4 分子生物學診斷
        4.5 細胞檢查法
    5 CSFV新型疫苗研究進展
        5.1 合成肽疫苗
        5.2 亞單位疫苗
        5.3 嵌合CSFV疫苗
        5.4 基因缺失型弱毒疫苗
        5.5 DNA疫苗
    6 P.pastoris表達系統(tǒng)的一般特征
        6.1 外源基因的內在特性的影響
        6.2 宿主菌的選擇
        6.3 表達載體
        6.4 發(fā)酵條件對表達的影響
第二章 CSFV NS2-3 蛋白抗原表位集中區(qū)的真核表達與鑒定
    1 材料
        1.1 質粒和宿主菌
        1.2 主要試劑和酶類
        1.3 主要儀器設備
        1.4 主要試劑配制
    2 方法
        2.1 CSFV NS2-3_2 基因的PCR擴增、克隆和鑒定
        2.2 重組克隆載體的構建
        2.3 重組表達質粒p PICZαC-NS2-3_2 的構建
        2.4 攜帶目的基因的重組酵母的構建
        2.5 高抗性重組子的初步誘導表達
        2.6 誘導條件的摸索
        2.7 表達產物的SDS-PAGE鑒定
        2.8 目的蛋白的Western blotting鑒定
    3 結果與分析
        3.1 目的基因的PCR擴增
        3.2 重組克隆質粒的轉化
        3.3 重組克隆質粒的菌液PCR鑒定
        3.4 重組克隆質粒的雙酶切鑒定
        3.5 CSFV NS2-3_2 和表達載體的連接
        3.6 重組表達質粒p PICZαC-NS2-3_2 的PCR鑒定和雙酶切鑒定
        3.7 高抗性重組酵母菌的篩選
        3.8 高抗性重組酵母菌菌液PCR鑒定
        3.9 表達產物的SDS-PAGE分析
    4 討論
        4.1 密碼子偏嗜性
        4.2 A+T含量
        4.3 過度糖基化
        4.4 目的蛋白的降解
        4.5 甲醇的影響
        4.6 信號肽的影響
    5 小結
全文總結
參考文獻
攻讀學位期間取得的成績
附錄
致謝


【參考文獻】：
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