豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)重要的病毒性傳染病之一。PRRSV感染的靶細胞主要為肺泡巨噬細胞等免疫細胞,常導(dǎo)致動物機體發(fā)生免疫抑制,并促進其他病原的共感染。因此,深入研究PRRSV的致病機制對于研發(fā)新型疫苗和抗病毒藥物具有重要意義。近年來對RPRSV的致病機理進行了多方面的深入研究,但對于該病毒與宿主細胞之間的相互作用機制以及病毒免疫逃逸機制尚不完全清楚。最新的研究發(fā)現(xiàn)PRRSV感染可以顯著誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬,并能促進自身復(fù)制,但卻未能解釋具體的分子調(diào)控機制。TRIM28又稱KAP1,是TRIM家族的成員之一。已知TRIM28是一個具有多種生物學(xué)功能的核蛋白,具有轉(zhuǎn)錄抑制因子活性和E3連接酶活性。最新的研究表明,TRIM28還能參與調(diào)節(jié)病毒復(fù)制和細胞自噬發(fā)生。但TRIM28是否在PRRSV感染過程發(fā)揮作用尚未有報道。利用Marc145細胞系為模型,我們發(fā)現(xiàn)PRRSV感染誘導(dǎo)細胞自噬產(chǎn)生時,可顯著增加細胞漿提取物中TRIM28（KAP1）的蛋白水平,但卻不影響TRIM28的mRNA表達。進一步利用免疫熒光和胞核胞質(zhì)分離實... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
符號說明
中文摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合癥
        1.1.1 豬繁殖與呼吸綜合癥概述
        1.1.2 PRRSV的分類與遺傳變異
        1.1.3 PRRSV的結(jié)構(gòu)及功能
        1.1.4 PRRSV的致病機制
    1.2 TRIM28 蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.1 TRIM28 的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 TRIM28 的功能與調(diào)控
    1.3 研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 質(zhì)粒、病毒和細胞
        2.1.2 主要試劑及抗體
        2.1.3 設(shè)備儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 感受態(tài)細胞制備
        2.2.3 質(zhì)粒的小量提取
        2.2.4 細胞的培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇
        2.2.5 病毒的擴增、純化及TCID_(50)的測定
        2.2.6 真核細胞轉(zhuǎn)染
        2.2.7 蛋白樣品的制備
        2.2.8 蛋白濃度測定(BCA法)
        2.2.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳
        2.2.10 免疫印跡
        2.2.11 間接免疫熒光
        2.2.12 胞核胞質(zhì)分離
        2.2.13 TRIM28 RNA干擾
        2.2.14 細胞總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄
        2.2.15 實時熒光定量PCR
        2.2.16 免疫共沉淀
        2.2.17 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 TRIM28 表達促進細胞自噬發(fā)生
    3.2 PRRSV感染上調(diào)TRIM28 蛋白表達
    3.3 PRRSV感染導(dǎo)致TRIM28 蛋白從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞漿
    3.4 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp4 是導(dǎo)致TRIM28 出核的關(guān)鍵病毒蛋白
    3.5 PRRSV誘導(dǎo)TRIM28 出核依賴CRMI
    3.6 TRIM28 促進PRRSV誘導(dǎo)的自噬
    3.7 TRIM28 促進Vps34和Beclin1 相互作用
    3.8 TRIM28 促進了Vps34的SUMO化修飾
    3.9 TRIM28 抑制PRRSV的復(fù)制
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況



本文編號：3645033