柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（E.tenella）是分布最廣、致病力最強(qiáng)的幾種球蟲(chóng)之一,嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè),造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前藥物防治是控制球蟲(chóng)病的有效手段,但隨著抗球蟲(chóng)株的產(chǎn)生及綠色食品概念的形成,抗球蟲(chóng)新型疫苗的研究成為熱點(diǎn)。E.tenella SAG13表面抗原蛋白是基于DF-1細(xì)胞感染模型,通過(guò)分泌蛋白質(zhì)組分析篩選到的一種上調(diào)表達(dá)蛋白。為探究EtSAG13是否具有分泌特性,以及是否可以作為候選疫苗抗原蛋白,本研究對(duì)EtSAG13基因進(jìn)行原核表達(dá),以E.tenella子孢子cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,按照GenBank的基因序列合成引物,將合成的EtSAG13基因序列連接到pET28a（+）載體上,構(gòu)建了pET28a-SAG13重組質(zhì)粒,并將pET28a-SAG13重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中,利用IPTG誘導(dǎo)EtSAG13目的基因的表達(dá);用SDS-PAGE及免疫印跡法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行分析和鑒定。將EtSAG13表達(dá)的重組蛋白免疫BALB/c小鼠,制備鼠源多克隆抗體,進(jìn)行亞細(xì)胞定位,EtSAG13定位在E.tenella子孢子的表面,同時(shí)部分蛋白可以分泌到裂殖子細(xì)胞外,具有分泌特性。本研究將p... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：62 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
符號(hào)說(shuō)明
中文摘要
Abstract
前言
    1.1 雞球蟲(chóng)病概述
    1.2 雞球蟲(chóng)研究進(jìn)展
        1.2.1 雞球蟲(chóng)分子生物學(xué)研究進(jìn)展
        1.2.2 雞球蟲(chóng)分泌蛋白研究概況
            1.2.2.1 微線蛋白
            1.2.2.2 蛋白激酶
            1.2.2.3 棒狀體蛋白
    1.3 雞球蟲(chóng)病防治概況
        1.3.1 藥物防治
        1.3.2 疫苗研究進(jìn)展
            1.3.2.1 雞球蟲(chóng)免疫機(jī)制
            1.3.2.2 傳統(tǒng)疫苗和商品化疫苗
            1.3.2.3 新型疫苗研究進(jìn)展
        1.3.3 雞球蟲(chóng)免疫應(yīng)答的研究進(jìn)展
    1.4 EtSAGs家族蛋白
    1.5 本研究的目的和意義
2.材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 試驗(yàn)菌株和載體
        2.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與蟲(chóng)株
        2.1.3 主要試劑及試劑盒
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
        2.1.5 溶液配制
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成
        2.2.2 雞球蟲(chóng)復(fù)壯與傳代
        2.2.3 雞球蟲(chóng)的收集與孢子化卵囊的收集
        2.2.4 EtSAG13 基因的克隆與原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.4.1 EtSAG13 基因克隆與轉(zhuǎn)化
            2.2.4.2 EtSAG13 基因片段PCR產(chǎn)物的回收
            2.2.4.3 EtSAG13 目的基因片段和載體雙酶切和膠回收
            2.2.4.4 目的基因酶切產(chǎn)物與pET-28a(+)載體的連接
            2.2.4.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Top10 感受態(tài)細(xì)胞
            2.2.4.6 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定
            2.2.4.7 重組質(zhì)粒DNA的提取與鑒定
            2.2.4.8 陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序鑒定
        2.2.5 EtSAG13 重組蛋白的表達(dá)和純化
            2.2.5.1 EtSAG13 重組蛋白的原核表達(dá)
            2.2.5.2 EtSAG13 重組蛋白SDS-PAGE和 Western blot檢測(cè)
            2.2.5.3 重組EtSAG13 蛋白純化
        2.2.6 EtSAG13 鼠源多克隆抗體的制備及分泌蛋白鑒定
            2.2.6.1 EtSAG13 鼠源多克隆抗體的制備
            2.2.6.2 EtSAG13 的亞細(xì)胞定位分泌蛋白鑒定
        2.2.7 SAG13 蛋白免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)
            2.2.7.1 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)與免疫程序
            2.2.7.2 EtSAG13 亞單位疫苗免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)
                2.2.7.2.1 存活率
                2.2.7.2.2 增重效果
                2.2.7.2.3 卵囊排出量
                2.2.7.2.4 盲腸病變計(jì)分
                2.2.7.2.5 抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)評(píng)價(jià)
                2.2.7.2.6 血清和粘膜抗體檢測(cè)
                2.2.7.2.7 細(xì)胞免疫水平的檢測(cè)
                2.2.7.2.8 統(tǒng)計(jì)分析
3 結(jié)果
    3.1 SAG13 基因的克隆與原核表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.2 EtSAG13 重組克隆載體的測(cè)序結(jié)果
    3.3 EtSAG13 多克隆抗體的制備及鑒定結(jié)果
        3.3.1 SDS-PAGE與 Western Blot驗(yàn)證EtSAG13 蛋白的原核表達(dá)
        3.3.2 EtSAG13 原核重組蛋白的大量誘導(dǎo)及純化
        3.3.3 鼠源多克隆抗體的制備及分泌蛋白鑒定結(jié)果
        3.3.4 E.tenella蟲(chóng)體EtSAG13 蛋白間接免疫熒光定位結(jié)果
    3.4 EtSAG13 亞單位疫苗免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)
        3.4.1 體重增長(zhǎng)情況
        3.4.2 盲腸病變計(jì)分
        3.4.3 卵囊排出量
        3.4.4 抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)結(jié)果
        3.4.5 血清抗體水平檢測(cè)結(jié)果
        3.4.6 粘膜抗體水平檢測(cè)結(jié)果
        3.4.7 CD4~+、CD8~+T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果
4 討論
    4.1 EtSAG13 重組蛋白分泌蛋白鑒定
    4.2 原核表達(dá)EtSAG13 蛋白的意義及其免疫保護(hù)效果
    4.3 血液抗體和粘膜抗體以及T淋巴細(xì)胞在抗球蟲(chóng)感染免疫保護(hù)中的作用
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
論文發(fā)表情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)皮損組織中C3d,C4d,IgG,IgG4及CD123表達(dá)在診斷自身免疫性皮膚病中的應(yīng)用價(jià)值[J]. 鄧敏,周星雨,張靜,李亞萍.  中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2019(08)
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[5]中藥在雞球蟲(chóng)病治療中的應(yīng)用[J]. 李隨霞.  畜禽業(yè). 2019(01)
[6]免疫球蛋白G提純方法的研究進(jìn)展[J]. 李登亮,伊淑帥,郭衍冰,劉宏凱,牛江婷,董國(guó)英,胡桂學(xué).  中國(guó)獸醫(yī)雜志. 2018(12)
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博士論文
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[2]新型釀酒酵母表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建及雞球蟲(chóng)EtMic2活載體疫苗的免疫保護(hù)性研究[D]. 孫慧.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]堆型艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶DNA疫苗免疫保護(hù)作用及免疫機(jī)理研究[D]. 宋鴻雁.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010

碩士論文
[1]中藥方劑防治雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病的效果研究[D]. 趙瑞平.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
[2]柔嫩艾美耳球蟲(chóng)S07-IL-2與NA4-IL-2重組酵母蛋白的表達(dá)及其免疫效果評(píng)價(jià)[D]. 陳艷紅.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
[3]混合益生菌抗雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染效果評(píng)價(jià)[D]. 都慧潔.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
[4]表面展示柔嫩艾美耳球蟲(chóng)EtMIC2蛋白重組乳酸菌的構(gòu)建及免疫保護(hù)效果研究[D]. 周芳玉.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[5]雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)多表位亞單位疫苗的構(gòu)建與免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)[D]. 韓林臻.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[6]毒害艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與篩選及3-1E基因的克隆表達(dá)[D]. 蔡秀清.揚(yáng)州大學(xué) 2016
[7]柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Etgam59基因克隆表達(dá)與免疫保護(hù)性研究[D]. 朱玉蘭.揚(yáng)州大學(xué) 2015
[8]巨型艾美耳球蟲(chóng)Emgam56基因在畢赤酵母中的表達(dá)及其免疫保護(hù)性研究[D]. 鄧長(zhǎng)靜.揚(yáng)州大學(xué) 2015
[9]酵母表面展示EtMic1蛋白不同結(jié)構(gòu)域及其作為抗球蟲(chóng)活載體疫苗的研究[D]. 陳佩佩.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[10]雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)RC株表面抗原SAG17、SAG18和未知蛋白HP基因的克隆與原核表達(dá)[D]. 許李麗.西南大學(xué) 2013



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