豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus Type 2,PCV2）是一種單鏈環(huán)狀DNA病毒,是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）為主的豬圓環(huán)病毒�。╬orcine circovirus associated disease,PCVAD）的關(guān)鍵病原分子（Karuppannan and Opriessnig 2017）。被PCV2感染的豬,可發(fā)生免疫抑制,天然免疫應(yīng)答減弱,對多種病原易感,導(dǎo)致嚴(yán)重的多病原混合感染,病死率高,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。通常,病毒感染機體后會被機體識別并引起相應(yīng)的免疫應(yīng)答,cGAS/STING作為一種關(guān)鍵的DNA感受通路,在機體抗病毒免疫反應(yīng)以及一些炎性因子的分泌過程中發(fā)揮重要作用,但是cGAS、STING在PCV2感染機體引起機體免疫抑制的過程中怎樣發(fā)揮作用目前還沒有研究報道。本試驗以PK-15細(xì)胞作為基因編輯的模式細(xì)胞,運用靶向于豬c GAS基因和sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒敲除系統(tǒng)感染野生型PK-15細(xì)胞,并用適當(dāng)濃度的嘌呤霉素進行篩選,得到陽性單克隆細(xì)胞,經(jīng)過擴大培養(yǎng),成功獲取了cGAS基因敲除細(xì)胞系和sting基... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
文獻(xiàn)綜述
    第一章 cGAS/STING在抗病毒免疫中的調(diào)控作用
        1.1 cGAS/STING通路簡介
            1.1.1 cGAS
            1.1.2 STING
            1.1.3 cGAS/STING通路
        1.2 cGAS/STING通路在抗病毒免疫中的作用與調(diào)控機制
            1.2.1 cGAS/STING在病毒誘導(dǎo)的I型干擾素產(chǎn)生中的作用
            1.2.2 cGAS/STING對不同病毒復(fù)制的影響
        1.3 cGAS/STING通路對PCV2感染的調(diào)控作用
            1.3.1 PCV2簡介
            1.3.2 PCV2的復(fù)制及致病特征
            1.3.3 cGAS/STING通路在抗PCV2感染中的作用
        1.4 本研究的目的和意義
試驗研究
    第二章 cGAS、sting基因敲除細(xì)胞的構(gòu)建和鑒定
        2.1 試劑材料
            2.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒
            2.1.2 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 主要試劑配制
        2.2 方法
            2.2.1 重組目的質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.2 慢病毒包裝
            2.2.3 慢病毒滴度測定
            2.2.4 嘌呤霉素最適濃度的確定
            2.2.5 篩選穩(wěn)定感染的陽性細(xì)胞
            2.2.6 慢病毒感染后細(xì)胞形態(tài)變化及活性檢測
            2.2.7 Western Blotting檢測
            2.2.8 細(xì)胞基因組測序鑒定
        2.3 結(jié)果與分析
            2.3.1 cGAS基因和sting基因敲除位點的確定
            2.3.2 雙酶切鑒定
            2.3.3 慢病毒滴度測定結(jié)果
            2.3.4 慢病毒感染細(xì)胞形態(tài)及活力變化
            2.3.5 Western blotting檢測慢病毒感染細(xì)胞的cGAS基因和sting基因敲除情況
            2.3.6 細(xì)胞基因組測序
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 cGAS/STING缺失對PCV2感染PK-15 細(xì)胞抗病毒免疫的影響
        3.1 試劑材料
            3.1.1 主要試劑
            3.1.2 主要儀器
            3.1.3 試驗溶液的配制
        3.2 方法
            3.2.1 PCV2增殖以及滴度測定
            3.2.2 Real-time PCR/ELISA檢測IFN-β 的變化
            3.2.3 Realtime PCR/ELISA檢測IL-6 分泌的變化
            3.2.4 Realtime PCR/ELISA檢測IL-1β 分泌的變化
            3.2.5 cGAS/STING對PCV2復(fù)制的影響
            3.2.6 統(tǒng)計分析
        3.3 結(jié)果與分析
            3.3.1 PCV2滴度測定結(jié)果
            3.3.2 PCV2感染后PK-15 細(xì)胞中IFN-β、IL-6、IL-1β 的動力學(xué)變化
            3.3.3 cGAS/STING對PCV2感染細(xì)胞中IFN-β 表達(dá)的影響
            3.3.4 cGAS/STING對PCV2感染細(xì)胞中IL-6 表達(dá)的影響
            3.3.5 cGAS/STING對PCV2感染細(xì)胞中IL-1β 表達(dá)的影響
            3.3.6 cGAS/STING對PCV2復(fù)制的影響
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
結(jié)論與創(chuàng)新點
參考文獻(xiàn)
主要縮略詞和中英文對照表（Abbreviation Index）
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬圓環(huán)病毒2型與豬圓環(huán)病毒相關(guān)性系統(tǒng)疾病的回顧及展望[J]. 顧金燕,邢剛,雷靜,劉斐,周繼勇.  生物工程學(xué)報. 2015(06)
[2]病毒感染引發(fā)天然免疫細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進展[J]. 孫文香,蔣爭凡.  中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報. 2013(05)
[3]STING在宿主天然免疫信號通路中的調(diào)節(jié)作用[J]. 鄭洋,邢雅玲,陳曉娟,楊星星,王凱,陳忠斌.  生物化學(xué)與生物物理進展. 2013(01)
[4]細(xì)胞內(nèi)模式識別受體研究進展[J]. 閆鴻斌,高閃電,賈萬忠,才學(xué)鵬.  免疫學(xué)雜志. 2008(03)
[5]最新動物病毒分類簡介[J]. 陸承平.  中國病毒學(xué). 2005(06)



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