口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD）是一種可引起偶蹄動(dòng)物發(fā)病的高度接觸性傳染病。該病是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起的,典型癥狀是病畜高熱,跛行,在蹄部、舌、口、乳房等處產(chǎn)生水泡,該病發(fā)病率高,但死亡率低,造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)于該病的防治主要通過(guò)疫苗接種,但是FMDV有七個(gè)不同的血清型,抗原變異快,不同血清型之間沒(méi)有交叉保護(hù),因而給本病的預(yù)防帶來(lái)一定的困難。另外,目前主要使用的是滅活疫苗,但其在使用和生產(chǎn)過(guò)程中存在安全風(fēng)險(xiǎn),因此研制安全、高效的新型生物制劑成為越來(lái)越多研究者關(guān)注的問(wèn)題。干擾素（IFN）是一種多效的細(xì)胞因子,它能作用于相應(yīng)的受體,激活信號(hào)通路并誘導(dǎo)干擾素刺激基因（ISGs）的大量轉(zhuǎn)錄,表達(dá)相關(guān)的功能性蛋白,最終起到抗病毒作用。Ⅰ型和Ⅱ型干擾素作用于不同的受體,有協(xié)同抗病毒效果。IFITM3是由IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種跨膜蛋白家族成員,在抗病毒、抗腫瘤及免疫監(jiān)視等方面發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)?xiàng)U狀病毒越來(lái)越多的應(yīng)用到研究和臨床生產(chǎn)中,不僅在于其自身在表達(dá)修飾方面的優(yōu)勢(shì),它還不存在安全性問(wèn)... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)列表(Abbreviation)
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 口蹄疫簡(jiǎn)介
        1.1.1 簡(jiǎn)述口蹄疫的危害及其現(xiàn)狀
        1.1.2 口蹄疫病毒的分子生物學(xué)
        1.1.3 口蹄疫現(xiàn)狀及新型口蹄疫疫苗
            1.1.3.1 傳統(tǒng)疫苗
            1.1.3.2 新型FMD疫苗
    1.2 干擾素簡(jiǎn)介
        1.2.1 干擾素的發(fā)展和作用
        1.2.2 干擾素的分型
        1.2.3 IFN的誘導(dǎo)表達(dá)
        1.2.4 IFN的作用機(jī)理
        1.2.5 干擾素刺激基因(ISGs)
        1.2.6 干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITM)
    1.3 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)
        1.3.1 簡(jiǎn)述桿狀病毒
        1.3.2 桿狀病毒作為載體的進(jìn)展
        1.3.3 桿狀病毒作為載體的優(yōu)勢(shì)
2 目的和意義
3 材料和方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌種、細(xì)胞及毒株
        3.1.2 質(zhì)粒載體
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 主要培養(yǎng)基的配制
        3.1.5 主要緩沖液
            3.1.5.1 質(zhì)粒提取緩沖液
            3.1.5.2 Western blot緩沖液
        3.1.6 其他溶液
        3.1.7 本實(shí)驗(yàn)所用各種PCR引物
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 PCR獲得目的基因
        3.2.2 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
        3.2.3 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)
        3.2.4 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物回收與純化
        3.2.5 外源DNA片段與載體的連接反應(yīng)
        3.2.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)
        3.2.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.8 重組質(zhì)粒的小量制備(OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒)
        3.2.9 質(zhì)粒DNA的定量
        3.2.10 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.2.11 藍(lán)白斑篩選
        3.2.12 重組穿梭載體(Bacmid)的提取
        3.2.13 脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染
        3.2.14 重組假型桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞
        3.2.15 構(gòu)建重組假型桿狀病毒的操作流程及示意圖
        3.2.16 Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)
            3.2.16.1 樣品的處理
            3.2.16.2 SDS-PAGE電泳
            3.2.16.3 Western blot檢測(cè)
        3.2.17 空斑減少試驗(yàn)檢測(cè)
        3.2.18 熒光定量PCR
            3.2.18.1 樣品的制備
            3.2.18.2 總RNA的提取
            3.2.18.3 cDNA的合成
            3.2.18.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
                3.2.18.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)
                3.2.18.4.2 實(shí)時(shí)熒光PCR相對(duì)定量mRNA表達(dá)水平的計(jì)算
        3.2.19 動(dòng)物試驗(yàn)
            3.2.19.1 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的動(dòng)物試驗(yàn)方案
            3.2.19.2 動(dòng)物試驗(yàn)血清的中和抗體檢測(cè)
            3.2.19.3 動(dòng)物試驗(yàn)血清的ELISA抗體檢測(cè)
            3.2.19.4 動(dòng)物試驗(yàn)血清的ELISA抗體檢測(cè)(韓國(guó)金諾ELISA試劑盒)
            3.2.19.5 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)細(xì)胞的分離
        3.2.20 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
4 結(jié)果與分析
    4.1 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的構(gòu)建及抗病毒活性的研究
        4.1.1 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的構(gòu)建
            4.1.1.1 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α的構(gòu)建
                4.1.1.1.1 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
                4.1.1.1.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α的獲得
                4.1.1.1.3 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α的Western blot檢測(cè)
            4.1.1.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ的獲得
                4.1.1.2.1 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
                4.1.1.2.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ的獲得
            4.1.1.3 重組桿狀病毒Ac-VSVG-sIFITM3的獲得
                4.1.1.3.1 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
                4.1.1.3.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-sIFITM3的獲得
                4.1.1.3.3 重組桿狀病毒Ac-VSVG-sIFITM3的Western blot檢測(cè)
            4.1.1.4 Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的抗病毒效果檢測(cè)
                4.1.1.4.1 Ac-VSVG-IFN-α在細(xì)胞上的抗病毒效果
                4.1.1.4.2 Ac-VSVG-IFN-γ在細(xì)胞上的抗病毒效果
                4.1.1.4.3 Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后ISGs的轉(zhuǎn)錄
                4.1.1.4.4 Ac-VSVG-sIFITM3在細(xì)胞上的抗病毒效果
                4.1.1.4.5 重組桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-α/IFN-γ/sIFITM3的協(xié)同抗病毒效應(yīng)的初步探索
                    4.1.1.4.5.1 Ac-VSVG-IFN-α和Ac-VSVG-IFN-γ的協(xié)同抗病毒效應(yīng)
                    4.1.1.4.5.2 Ac-VSVG-IFN-γ和Ac-VSVG-sIFITM3的協(xié)同抗病毒效應(yīng)
                    4.1.1.4.5.3 Ac-VSVG-IFN-γ/sIFITM3的協(xié)同抗病毒效應(yīng)
    4.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的構(gòu)建及免疫效力試驗(yàn)
        4.2.1 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的獲得
            4.2.1.1 FMDV P1基因的獲得和轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
            4.2.1.2 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的獲得
        4.2.2 Ac-VSVG-IFN-γ-2P1在細(xì)胞上的抗病毒效果
        4.2.3 重組假型桿狀病毒Ac-VSVG-IFN-γ-2P1的動(dòng)物試驗(yàn)
            4.2.3.1 動(dòng)物試驗(yàn)血清ELISA水平的檢測(cè)
            4.2.3.2 中和抗體水平的檢測(cè)
            4.2.3.3 PBMCs中ISGs的檢測(cè)
5 討論
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3605708